1.激素檢測
（1）血17-羥孕酮測定
17-羥孕酮測定是篩查、診斷、監測21-羥化酶缺乏癥的重要指標。患者血液17-羥孕酮可高于正常人數十至幾百倍，一般血濃度可超過60nmol/L，非典型患者經促腎上腺皮質激素刺激后，血濃度可上升至150～300nmol/L。通過干血斑17-羥孕酮測定，可進行新生兒先天性腎上腺皮質增生癥篩查。
（2）24小時尿17-酮類固醇和17-羥類固醇測定
尿17-酮類固醇包括雄酮、脫氫異雄酮，是腎上腺皮質和睪丸所分泌的雄激素和代謝產物。患者尿17-酮類固醇明顯升高，而17-羥類固醇正常或偏低。
（3）血漿促腎上腺皮質激素和睪酮測定
大多數患者尤其失鹽型，血漿促腎上腺皮質激素和睪酮不同程度升高，非典型性患者可在正常范圍內。
（4）血皮質醇測定
正常人腎上腺皮質分泌皮質醇呈晝夜變化，一般清晨6～8時最高，午夜12時最低。21-羥化酶缺乏癥經典型重型患者血液皮質醇濃度降低，非典型患者可在正常范圍。
2.實驗室檢查
經典型患者血清電解質濃度呈低鈉、低氯和高鉀血癥。
3.基因檢測
CYP21A2基因分析可協助診斷，指導遺傳咨詢。患兒CYP21A2基因缺陷大多表現為點突變，可伴C4和A基因缺失或重復。