目前已知有三種方法可以用來在體外連接DNA片段：
第一種方法是，用DNA連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片段；
第二種方法是，用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來，或是用末端脫氧核苷酸轉移酶給具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA連接酶將它們連接起來；
第三種方法是，先在DNA片段末端加上化學合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。這三種方法雖然互有差異，但共同的一點都是利用DNA連接酶所具有的連接和封閉單鏈DNA的功能。