1、化學合成siRNA
合成siRNA應用廣泛，這種方法的得率和純度都比較高。對合成siRNA還可以進行一系列化學修飾以提高siRNA的穩定性、降低脫靶效應，以及（或者）阻止激活天然免疫反應。多家公司，包括Ambion、Thermo Scientific Dharmacon、QIAGEN和Sigma-Aldrich Proligo等都能提供高質量的合成siRNA。在用于細胞之前，合成的正義和反義siRNA需在體外復性形成雙鏈siRNA（方案1）。
2、利用酶學反應從長鏈dsRNA生成siRNA
利用重組Dicer酶或者細菌RNase Ⅲ對體外轉錄獲得的長鏈dsRNA進行酶學消化也可以獲得雙鏈siRNA（Yang et al. 2002）。與合成siRNA相比，對長鏈dsRNA酶消化可以生成不同種類的siRNA，提高了生成功能性siRNA的可能性。然而，體外酶學反應生成siRNA的主要不足之處在于：這些siRNA在使用時不易選擇對照。理論上，對照siRNA不應該與實驗siRNA具備相同的種子序列。由于體外酶切生成的確切siRNA無從得知，那么也就無法選擇精確的對照，因此，無法區分究竟是既定靶標mRNA還是脫靶基因的特定表型表達發生下調。
3、體外轉錄
利用合成的、含有噬菌體啟動子的DNA寡核苷酸模板，經體外轉錄可以生成siRNA。通常，這一方法通過核酸酶或者核酶消化，確保產物擁有確定的末端以及（或者）5’端單磷酸或者羥基末端。這一方式能夠以較低成本快速生成多個不同siRNA，但是風險主要存在于污染的三磷酸RNA會觸發天然免疫反應（Kimet al. 2004）。