典型PCR操作程序與優化方法

一、 試劑
(1)引物根據待擴增DNA不同，引物亦不同，引物的設計見
(2)耐熱DNA聚合酶：此酶是從耐熱細菌中分離出來的，能耐受高溫(93—100c)，不同耐熱DNA聚合酶的特性詳見本章第4節。 Perkin—E1mer—cetus公司、N、F、Bio1ab、PharMacia公司、國內華美公司、復旦．大學和中國醫學科學院友誼公司等均有商品供應。
(3)10x PCR緩沖液： 500mm01／L KCl； 100mmol／L Tris一HCl(pH8.4， 20c)，150mmol／L MgCl2， lmg／m1明膠。
(4)5mmo1／L dNTP貯備液：將dATP，dCTP，dGTPT和dTTP鈉鹽各100mg合并，加3m1滅菌去離子水溶解，用NaoH調pH至中性，分裝每份 300v1， - 20℃保存，dNTP濃度zui好用uv吸收法精確測定。另外。現在已有中性dNTP溶液商品供應(Sigma公司和Pharmacia公司等)。
(5)標本處理試劑：不同標本所需試劑不同，根據具體情況而定

二、操作程序
利用PcR擴增的操作程序基本相同，只是根據引物與靶序列的不同，選擇不同的反應體系與循環參數，基本的操作是將PcR必需反應成分加入一微量離心管中，然后置于一定的循環參數條件下進行循環擴增。每個實驗室或每個人都有不同的操作習慣，但需遵守一定的操作規范。我們推薦下述操作程序，因這樣操作可zui大程度地增加反應的成功率。
(1)向一微量離心管中依次加入：
ddH2 O補至終體積(終體積50~100ul)
10 x PCR緩沖液 1／10體積
dNTP 各200umol／L
引物 各1umol／L
DNA模板
混勻后，離心15s使反應成分集于管底。
(2)加石蠟油50—100ul于反應液表面以防蒸發。置反應管于97c變性7min(染色體DNA)或5min(質粒DNA)。
(3)冷至延伸溫度時，加入1—5U Taq DNA聚合酶，在此溫度作用1min。
(4)于變性溫度下使模板DNA變性適當時間。
(5)在復性溫度下使引物與模板雜交一定時間。
(6)在延伸溫度下使復性的引物延伸合適的時間。
(7)重復(4)一(6)步25—30次。每次即為一個PcR循環。
(8)微量瓊脂德凝膠電泳檢查擴增產物(見本章第7節)。
上述過程可以用PcR自動熱循環儀進行，也可以設定3個恒溫水浴鍋手工操作。