決定DNA在瓊脂糖凝膠電泳色譜儀中遷移速率的因素有DNA分子大小、瓊脂糖凝膠濃度、DNA構象、瓊脂糖凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠、所用電壓、電泳緩沖液等。
一、DNA分子大小：
雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速率與其堿基對數的常用對數成反比。分子越大，遷移越慢，因為摩擦力越大，也因為大分子通過凝膠孔的效率低于較小的分子。
二、瓊脂糖凝膠濃度：
給定大小的線狀DNA段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移速率不同。
三、DNA構象：
超螺旋環狀（Ⅰ型）、切口環狀（Ⅱ型）和線狀（Ⅲ型）DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率不同，三種類型的移速速率主要取決于瓊脂糖凝膠的濃度和類型，電流強度、緩沖液離子強度和Ⅰ型超螺旋絞緊的程度也影響遷移速率。在一些條件下，Ⅰ型DNA比Ⅲ型遷移得快，但在另一些條件下，順序可能會顛倒。絕大多數情況下，區分不同構象DNA的需求很簡單，主要是區分未處理的環狀DNA樣品和單一位點經限制酶作用線狀化的同一DNA樣品。
四、瓊脂糖凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠：
溴化乙錠插入雙鏈DNA會造成其負電荷減少，剛性和長度增加，線狀DNA－染料復合物在瓊脂糖凝膠中的遷移速率會降低約15%。
五、所用電壓：
低電壓下DNA段的遷移速率與所用電壓成正比。電壓升高時，高分子質量片段的遷移速率為不成比例的增加。所以，當電壓升高時，瓊脂糖凝膠分離的有效范圍反而減小。要獲得大于2kbDNA段的良好分辨率，所用電壓不應高于5～8V/cm。
六、電泳緩沖液：
DNA的泳動受電泳緩沖液的組成和離子強度的影響。缺乏離子（如用水替代電泳槽和瓊脂糖凝膠中的緩沖液），電導率會降至很低，DNA不是不動，就是遷移極慢。離子強度高時，電導率高，即使應用適中的電壓也會產生大量熱能，嚴重時凝膠會熔化，DNA會變性。