| 實驗方法原理 | 剪碎的組織放在胰蛋白酶中于4°C 放置16~18h ，去除胰蛋白酶后溫育并于溫培養基中分散細胞。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 組織 DBSS 粗制胰蛋白酶 |
| 試劑、試劑盒 | 生長培養基 皮氏平皿 |
| 儀器、耗材 | 培養瓶 鑷子 移液管 錐形瓶 剪刀 冰浴 |
| 實驗步驟 | 1. 將組織（1~5 g，預先稱重）移入加有新配制的無菌 DBSS 的皮氏培養皿中，清洗。 2. 轉入另一培養皿中，切除多余組織如脂肪和壞死組織。 3. 轉入第三個培養皿中，用交叉的手術刀細切成大約 3 mm3 的小塊。胚胎的器官若小于 3 mm3 ，可全部保留。 4. 用彎鑷子將組織塊移入一個預稱重的 15 ml 或 50 ml 無菌離心管內。 5. 讓組織塊沉降。 6. 用 DBSS 重懸清洗組織塊，沉降后去除上清，重復此步驟兩次以上。 7. 小心去除剩余液體，預先稱重。 8. 每克組織加入 10 ml 溶于 RPMI1640 或 S-MEM 的 0.25 % 胰蛋白酶（0.25 粗制胰蛋白酶溶于無血清的 RPMI1640或 MEM/Stirrer salt (S~MEM ) 中），置于 4°C 。 9. 4°C 放置 6~18 h 。 10. 小心吸去胰蛋白酶，余下組織及殘余胰蛋白酶（若需要，此時可加人 1~2 ml 其他酶，如膠原酶、透明質酸酶、脫氧核糖核酸酶等）。 11. 37°C 放置 20~30 min 。 12. 加入溫培養基，大約每 100 mg 初始的組織加 1 ml，輕輕上下吸打混合物至組織完全分散開。 13. 若部分組織未分散，細胞懸液可用無菌的平紋紗布或不銹鋼篩（100~200 μm )，或一次性使用的塑料篩濾網過濾細胞，或者讓大的組織塊沉降。當有較多組織時，可于每克組織中多加入 20 ml 培養基促進沉淀和隨后的懸液收集，通常 2~3 min 就足以去除大多數的大塊組織。 14. 用血球計數板或電子計數儀測定懸液的細胞密度，檢査活細胞比率。 15. 細胞群體為異源性，由于校準口徑較困難，因而初次使用電子計數儀時，需要用血球計數板來確認。 16. 將細胞懸液生長培養基（生長培養基（如DMEM/F12，含10% 胎牛血清））稀釋，使每毫升培養基含有 1×106 個細胞。按照需求接種于多個培養瓶（25 cm2、75cm2 培養瓶）中，大約每平方厘米為 2×105 個細胞。當存活率不明確或難以預知時，細胞計數便無價值（如腫瘤活檢時，死亡細胞的比例很高）。在這種情況下，建議按每毫升 5~25 mg 組織的濃度接種。 17. 間隔一定時間更換一次培養基（2~4 天，以 pH 下降為標準）。由于部分細胞黏附較慢甚至易于懸浮生長，所以丟棄上清前要先檢査上清液中是否有存活的細胞。  |
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