凝膠是由膠體粒子構成的立體網狀結構。網眼里吸滿水后凝膠膨脹呈柔軟而富于彈性的半固體狀態。人工合成的凝膠網眼較均勻地分布在凝膠顆粒上有如篩眼，小于篩眼的物質分子均可通過，大于篩眼的物質分子則不能，故稱為“分子篩”。凝膠之所以能將不同分子的物質分開是因為當被分離物質的各成分通過凝膠時，小于篩眼的分子將完全滲入凝膠網眼，并隨著流動相的移動沿凝膠網眼孔道移動，從一個顆粒的網眼流出，又進入另一顆粒的網眼，如此連續下去，直到流過整個凝膠柱為止，因而流程長、阻力大、流速慢；大于篩眼的分子則完全被篩眼排阻而不能進入凝膠網眼，只能隨流動相沿凝膠顆粒的間隙流動，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出層析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能進入或完全滲入凝膠篩眼之間的物質分子，則居中流出。這樣被分離物質即被按分子的大小分開。
用于凝膠層析的凝膠均為人工合成的產品，主要有交聯葡聚糖（商品名為Sephadex）、瓊脂糖（商品名為Sepharose）、聚丙烯酰胺凝膠（商品名為Bio–gel）及具有一定網眼的細玻璃珠等和這些凝膠的衍生物。
下面主要介紹葡聚糖凝膠，這是由葡萄糖的多聚物與1–氯– 2、3–環氧丙烷交連而成。環氧丙烷引入丙三醇基將鏈狀的多聚葡萄糖單位交聯起來，凝膠網眼的大小由多聚葡萄糖的分子和環氧丙烷的比例（交聯度）來控制。
葡聚糖具有較強的親水性，在水和電解質溶液中膨脹成為柔軟而富于彈性的凝膠，其吸水能力與葡聚糖凝膠的交聯度有密切關系。交聯度大的，孔徑小，吸水少，膨脹的程度小；交聯度小的，孔徑大，吸水多，膨脹的程度大。因此，葡聚糖凝膠孔徑的大小可以其吸水量的大小來表示，常以G–10至G–200號碼標記。G后面的數字是其吸水量（毫升水/克干膠）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量為2.5ml/2干膠。市售有G–10、G–5、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型號。G–75以上的膠因吸水量大，膨脹后形態柔軟易變，統稱為軟膠。G–75以下的稱為硬膠。
葡聚糖凝膠可分離的分子大小從幾百到數十萬。可根據被分離物質的分子大小及目的選擇使用。一般說Sephadex G–l0～15通常用于分離肽及“脫鹽”。Sephadex G–75～200用以分離各類蛋白質。
凝膠層析是一種物理分離法。葡聚糖凝膠基本上不帶電荷呈多惰性，不與被分離物質發生反應，所以分離的效果較好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羥基，能吸附少量蛋白質等被分離的物質。為了克服這個缺點，一般使用含有離子強度達0.08的NaCl等中性鹽緩沖液作洗脫液。
2．操作
（1）凝膠溶脹（水化）商品葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠均為干燥顆粒。使用前必須水化溶脹。商品瓊脂糖凝膠呈懸浮膠體可直接用，玻璃球不用溶脹。
凝膠溶脹有兩種方法：一種是將所需葡聚糖凝膠浸入蒸餾水中于室溫下溶脹；另一種是置于沸 水浴中溶脹。各種葡聚糖在上述溶脹方法中所需的時間見下表：
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型號 溶脹時間（小時）20~25℃ 分離范圍（蛋白質，Mr） |
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G-10 3 至700 G-15 3 至1500 G-25 3 1000~1500 G-50 3 1500~3000 G-75 24 3000~7000 |
必須浸泡足夠的時間以使凝膠充分溶脹 兩種方法中，沸水浴溶脹不但節省時間，還可以殺滅凝膠中污染的細菌并排出網眼中氣體。
凝膠溶脹后，需用蒸餾水洗滌幾次，每次應將沉降緩慢的細小顆粒隨水傾倒出去，以免在裝柱后產生阻塞現象，降低流速。洗后將凝膠浸泡在洗脫液中待用。
一支層析柱中應該裝入的干膠量可以用下法推算：稱取1g所需型號的葡聚糖干膠，放在5ml量筒中，用室溫溶脹的方法充分溶脹，觀察溶脹后凝膠的體積。然后在層析柱中加水到所需柱床高度，將水倒出，量取柱床體積。根據1g干膠溶脹后的體積和所需柱床體積，即可推算出干膠的需要量。