待分離的樣品中目標物質和其它雜質的分子量小于2倍且都在選擇的填料的排阻極限之外或者之內。若樣品中目標物質的分子量和其它雜質的分子量小于2倍時，建議嘗試其它方法分離，反之選擇凝膠過濾層析時，填料的選擇應根據樣品中目標分子的大小選擇最接近（大或小都可以）目標分子排阻極限的填料進行分離。
通過測柱效等方式確保柱床裝填的滿足凝膠過濾層析的過程。
根據樣品中目標物質和雜質的分子差異優化上樣量，如脫鹽等樣品中目標分子和雜質的分子量大于50倍時，上樣量可以達到柱床體積的25%，最高不超過30%，若樣品中目標分子和雜質的分子量差異在2-5倍時，通常上樣量控制在柱床體積的5%以內。
凝膠過濾的過程流速不宜過快，降低流速在一定程度上可以提高分離度。
隨著填料的使用，一些雜質的積累會使層析填料的孔徑發生變化（如堵塞，非特異性吸附積累，微生物污染，破碎等），導致其排阻能力發生偏差而影響分離度。此時可對填料進行CIP清洗，若清洗后還不能達到分離要求，就要更換新的填料。
樣品粘度過大也會導致分離度下降，粘度大的樣品在凝膠過濾時要對其進行稀釋處理在凝膠過濾；
樣品中目標物質和其它雜質的非特異性結合或者作用力，此時就要嘗試添加一些添加劑（如2%的Triton x-100,150mM NaCl等），減少樣品中各組份之間的作用力；
樣品的pH，離子強度對某些填料的柱床體積會產生一些影響，也會影響分離度，必要時可以優化樣品的緩沖液。