幾種食品中的菌落檢測方法評價

　　細菌總數測定是最常見的食品細菌污染指標之一，用來判定食品被細菌污染的程度，反映食品在生產、儲存、運輸、銷售過程中是否符合衛生要求，以便對被檢樣品做出適當的衛生學評價。其衛生學意義體現在：一方面是食品清潔狀態的標志；另一方面可用作貨架期評估，預測食品的耐保藏性。就定義而言，是指在一定條件下(如需氧情況、營養條件、pH、培養溫度和時間等)每克(每毫升)檢樣所生長出來的細菌菌落總數。

　　以菌落形成單位(colonyformingunit，CFU)表示。

　　最常用的細菌總數測定方法是菌落計數法(totalplatecount，TPC)。將被檢樣品制成幾個不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個稀釋液中分別取出1ml置于滅菌平皿中與營養瓊脂培養基混合，在一定溫度下(一般為36±1℃)，培養一定時間后(一般為48h)，記錄每個平皿中形成的菌落數量，依據稀釋倍數，計算出原始樣品中所含細菌菌落總數，以CFU／g(ml)報告。

　　TEMPO是一種新的以MPN(最大近似值)為計數原理的自動微生物定量檢測儀，可用于多種微生物目標菌，包括細菌總數(totalviablecount，TVC)的測定。完整的TEMPO工作站由準備站和讀卡站兩部分組成，通過無線網絡連接并即時傳輸數據。測定時，準備站部分進行樣品的登錄、稀釋和填充，將一定濃度的樣品稀釋液加入定量的專用培養基后，通過充填箱將樣品液充填至48孔測試卡后，經適當的培養(細菌總數測定要求37℃培養40h)，根據各孔道內細菌的生長狀況，由讀卡站進行熒光檢測，自動讀取結果并換算出樣品中的目標菌數值，以CFU／g(ml)報告。

　　本文對這兩種基于不同檢測原理的食品中細菌總數的測定方法進行了比較。

　　1材料與方法1.1培養基和試劑緩沖蛋白胨水(BPW-D)；平板計數瓊脂(standardmethodagar)。

　　1.2菌株枸櫞酸桿菌(ATCC8090)、大腸桿菌(ATCC51813)、沙門氏菌(ATCC41912)、金黃色葡萄球菌(ATCC12600)、臘樣芽孢桿菌(實驗室存)等。

　　1.3常用微生物檢驗設備干熱滅菌設備或濕熱滅菌設備、培養箱36±1℃、刻度吸管(0.1ml或1ml，準確度±5%)、培養皿(直徑90mm)、Bagmixer擊拍器及樣品袋、渦旋振蕩器、定量分液瓶(1～5ml)、天平(感量為0.01g)。

　　1.4TEMPO微生物定量檢測儀及TVC配套檢測試劑TEMPO準備站(條形碼掃描儀、樣品充填箱及電腦)；TEMPO讀卡站(條形碼掃描儀、讀卡箱、電腦及打印機)；TEMPO／TVC試劑盒(細菌計數用干粉培養基，48孔測試卡)。

　　1.5方法1.5.1菌落計數法［1，2］樣品制備無菌操作取25g檢樣，放入225ml生理鹽水中，擊拍均質，即為1：10的樣品勻液，再用生理鹽水依次制成10倍遞增稀釋的樣品液，如10-2、10-3、10-4……。

　　平板接種對一個樣品，選用合適的三個連續稀釋度的樣品液進行平板計數。分別用滅菌吸管吸取1ml樣品液放入適宜標志的平皿內，每個稀釋度用兩個平皿。分別加12～15ml平板計數瓊脂(已在45±1℃的水浴中恒溫)到各平皿中。立即傾斜和旋轉平皿，將其中的樣品液和瓊脂培養基充分混合。每個樣品從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用的時間不得超過20min.　　培養待瓊脂凝固后將平皿翻轉，立即放進36±1℃的恒溫培養箱內培養48±2h.培養后，立即計數每個平板上的菌落數。25～250個菌落為合適范圍。

　　計算和記錄數字適宜稀釋度的兩個平板的菌落數平均值或兩個稀釋度的平板菌落數平均值乘以相應的稀釋倍數計算得出每g(ml)樣品中的平板菌落數。

　　1.5.2TEMPO／TVC方法制樣無菌操作取25g樣品至樣品袋中，加入225ml緩沖蛋白胨水(BPW)，擊拍均質。向專用小瓶中加入3.0或3.9ml無菌水溶解干粉培養基。精確移取取1.0或0.1ml的樣品稀釋液加入3.0或3.9ml已溶解的專用培養基中，終體積為4ml(1.0ml樣品液＋3ml培養為1：40稀釋；0.1ml樣品液＋3.9ml培養為1：400稀釋)，充分混勻。通過TEMPO準備站電腦連接測試卡號和樣品編號，通過充填箱將樣品液充填至測試卡中。培養將測試卡插入培養／讀卡架，37℃培養40h.

　　讀卡在TEMPO讀卡站由讀卡箱通過光學方法自動讀卡，由電腦對結果進行統計學分析，以CFU／g樣品為單位顯示檢測結果。TEMPO的TVC(細菌總數)方法的計數范圍為10至4900000個／g.

　　2結果與分析2.1標準菌株的添加實驗將常見的食源性細菌枸櫞酸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和臘樣芽孢桿菌分別制成10倍遞增稀釋的菌懸液，用TEMPO／TVC法和菌落計數法同時進行檢測.

　　菌種ㄏlgTVC-lgTPCㄏa評價枸櫞酸桿菌(ATCC8090)0.020～0.477(n＝4)無顯著差異b大腸桿菌(ATCC51813)0～0.058(n＝4)無顯著差異沙門氏菌(ATCC41912)0.099～0.699(n＝4)無顯著差異金黃色葡萄球菌(ATCC12600)0.130～0.308(n＝5)無顯著差異臘樣芽孢桿菌(本實驗室存保)0.046～0.221(n＝4)無顯著差異注：a：lgTVC指TEMPO讀數的對數值；lgTPC指按菌落計數的對數值。b：經t檢驗，p＞0.05，兩種方法間無顯著差異；反之則為有顯著差異。

　　2.2自然樣品的檢測實驗選取多個種類的190個食品樣品，用TEMPO／TVC法與菌落計數法同時進行檢測，結果見表2.

　　2.3兩種方法對單一樣品的重復測量的不確定度評定取冷凍水餃樣品一份，取25g，放入225ml生理鹽水中，擊拍均質，再用生理鹽水稀釋為1：100的樣品液，分別取10ml各用TEMPO／TVC法與菌落計數法進行10次重復測量，計算由散發引起的兩種測量方法的不確定度。

　　3討論國內外細菌總數測定的標準方法大同小異，絕大多數采用了菌落計數法。只在某些具體要求方面稍有差別，如有的標準方法在樣品稀釋和傾注培養時，特別對吸管內液體的流速，稀釋液的振蕩幅度、時間和次數以及放置時間等作了較具體的規定以確保精確性。不同的標準方法在平皿培養的溫度和時間上或者在計數環節中選取的稀釋度的計數有效值范圍可能略有出入。目前我國對食品中細菌總數的測定方法主要是參照GB4789.

　　2-2003《中華人民共和國國家標準食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定》或SN0168-92《中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準出口食品菌落計數》，兩者所采用的也均為此法。基本操作一般包括：樣品的均質和稀釋，傾注平皿，37℃培養48h和計數報告。作為傳統的食品微生物檢驗方法，其結果具有權威性，但亦不能避免耗費時間和耗費人力較多的缺點。　　最大近似值(mostprobablenumber，MPN)計數又稱稀釋培養計數，是樣品中活菌密度的估測。將待測樣品作一系列稀釋，一直稀釋到將少量(lm1)的樣品液接種到新鮮培養基中沒有或極少出現生長繁殖。根據沒有生長的最低稀釋度與出現生長的最高稀釋度，采用“最大近似值”理論，可以計算出樣品單位體積中細菌數的近似值。實際操作中，通常根據不同的目標菌的檢測要求，可選擇3～5個連續稀釋度，每個稀釋度重復接種3～10管，根據有細菌生長的管數檢索相應的MPN值表，報告單位重量(或體積)的樣品中細菌的MPN值。

　　在食品衛生檢驗方法中用到最多的是9管法，即取3個連續稀釋度，每個稀釋度接種3管。最大近似值法的優點是在細菌含量較低(＜100／g)時，以及測定在一個混雜的微生物群落中雖不占優勢，但卻具有特殊生理功能的類群(如大腸菌群的數量)時尤其有用。缺點是結果是近似值而非絕對值，作為定量方法，在讀取結果時需考慮95%的可信區間。

　　TEMPO／TVC法是一種新的基于MPN原理的儀器自動檢測方法。其專用試劑盒提供了：①使細菌快速生長的培養基，內含復合熒光底物，細菌生長過程中，降解至少一種底物，可產生熒光信號；②48孔測試卡，包含了3種不同大小的獨立孔道，相當于3個連續稀釋度，每個稀釋度重復16管。樣品液充填后，經培養出現細菌生長的孔道會產生熒光，被讀卡箱檢測，根據陽性孔道的大小和數目(有／無熒光)由專門的數據處理軟件計算原樣本中的微生物數量，以CFU／g形式報告結果，計數范圍主要有兩種：10～49000CFU／g和100～490000CFU／g.與傳統的MPN計數檢驗方法相比，單個稀釋度的重復管數達16個，總管數達48個，還可根據用戶需要將稀釋度增加到6個，使總管數達96個，按統計學原理可見，TEMPO／TVC的精確度大大高于傳統的9管法MPN值測定法；其二，TEMPO／TVC的結果是經換算的絕對計數值，單位為CFU／g，其結果與菌落計數法的結果可進行比較。

　　本文在對190個不同種類的自然樣品的檢測比較中，發現基于不同的檢測原理，但TEMPO／TVC法與菌落計數法在檢測結果上有較高的符合性。對計數范圍

　　內的160個樣品，將兩種檢驗方法取得的數據進行回歸分析，發現兩者具有很高的相關性和一致性(y＝0.99x)，ㄏlgTVC-lgTPCㄏ＞1的樣本僅有5個；而超過計數范圍的30個樣品結果均一致，即結果均小于10CFU／g或者均大于49000CFU／g或490000CFU／g.自然樣品的總符合率達到97.4%。

　　本文選取了食品衛生經常涉及的革蘭氏陽性細菌(包括1株產芽孢桿菌)和革蘭氏陰性細菌作為添加試驗的標準菌株，TEMPO／TVC法和菌落計數法的結果經t檢驗無差異，亦說明了TEMPO／TVC適應菌株的范圍與菌落計數法一致。

　　讀數因素是不確定度來源的一個重要分量，也是引起手工和自動化操作間結果差異的主要因素之一。菌落計數法測定細菌總數，是基于對平板上菌落的觀察和計數結果，主要依賴操作人員的判斷，因此總是會增加或降低檢測結果的不確定度；而TEMPO／TVC法由儀器進行自動的讀數，也會因固有設置而產生測量不確定度。本文對兩種方法就單一樣品重復測量的不確定度進行了評定。考慮到對相同樣品，應用相同稀釋度、稀釋劑和培養溫度，TEMPO／TVC法和菌落計數法在不確定度來源上的區別主要是讀數，以及微生物檢驗的特點，本文主要對由散發引起的測量不確定度(A類不確定度)作了評定。結果TEMPO／TVC法和菌落計數法的不確定度(以取值區間表示)分別為1.5×104～3.3×104CFU／g和2.7×104～4.5×104C。