分光光度計采用一個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源，光線透過測試的樣品后，部分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
單色光輻射穿過被測物質溶液時，被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關系如下式：
A=-lg(I/I0)=-lgT=kLc
式中 :A 為吸光度；
I0為入射的單色光強度；
I 為透射的單色光強度；
T 為物質的透射率；
k 為摩爾吸收系數；
L 為被分析物質的光程，即比色皿的邊長；
c 為物質的濃度；