PCR引物決定PCR的特異性，引物的設計就顯得尤為重要。下面以已知DNA序列設計引物為例介紹設計引物應考慮的幾個方面：
1、GC比值：眾所周知,堿基對中的GC之間有三條氫鍵，AT之間有兩條氫鍵，GC和AT在引物序列中的合理比例是設定PCR中退火溫度的重要依據。通常在一個引物中GC和AT各半即可。
2、長度：通常15-20bp即可。由于目的不同，有時引物長些，但太短會影響引物的特異性。
3、方向：設計出的引物永遠是5'-3'方向,所以正向引物是與一股模板DNA序列相一致的，而反向引物則與這股模板DNA序列相互補。
4、酶切位點：如果想克隆所放大的DNA片段，通常在引物的5'端設計適當的限制性酶切位點，使進一步的克隆工作更容易。一對引物可用一種或兩種酶切位點，這取決于設計者，兩種不同的酶切位點使克隆具有方向性。
5、啟始和終止密碼：如果想表達所放大的DNA片段，所用的克隆載體又不含啟始密碼和終止密碼，應將其設計在引物的酶切位點之后，特異性DNA序列之前。
6、其它：如果表達的融合蛋白用親合層析方法純化，可將必要的序列設計在引物中以使所表達的融合蛋白易于純化。【易生物——找儀器、試劑、服務，盡在易生物 www.ebioe.com】
（三）連接反應
將載體質粒DNA和外源基因DNA在DNA連接酶的作用下，雙鏈DNA片段相鄰的5'端磷酸與3'端羥基之間形成磷酸二酯鍵，形成重組質粒，這是分子克隆技術的核心步驟。在連接反應進行之前，質粒和外源基因DNA分別用同樣的限制性內切酶消化，使它們成為含有同樣粘性末端或鈍端的線性DNA，這是連接成功的先決條件。下面介紹連接反應的程序。
1、模板DNA的準備
在進行DNA重組以前，通常要先將DNA分子用限制性內切酶消化，使兩種DNA分子的末端產生相同的粘性末端或平齊末端。通常按下列比例進行：
1. 雙蒸溜水 適量
2. 10× 酶緩沖液 1/10容量
3. DNA 多少μl
4. 限制性內切酶 1/10容量（每微克DNA用1-10單位）
總容量（根據DNA分子量來確定，通常10-100μl）。
混合后37℃溫育30-120min。
2、連接反應
在DNA連接酶的作用下，將外源基因DNA片段和線性質粒DNA連接起來構成重組質粒的過程。通常按下列比例進行：
1. 雙蒸溜水 適量
2. 10× 酶緩沖液 1/10容量
3. 質粒DNA 適量
4. DNA插入片段 適量
5. 限制性內切酶 1/10容量(每微克DNA用1-10單位)
總容量（根據DNA分子量來確定，通常10-20μl）。
混合后置14-16℃水浴6-12小時。
[注意]
通常DNA插入片段的量是載體DNA的3倍，這需根據DNA分子量計算，而不取決于濃度。
（四）重組質粒的轉化
DNA插入片段和質粒DNA在體外連接形成重組質粒后，需要被導入到細胞內才能進行擴增和表達。接受重組DNA分子的細胞稱作受體細胞或宿主細胞。受體細胞分為原核細胞（如大腸桿菌）和真核細胞（如酵母、哺乳動物細胞及昆蟲細胞）。原核細胞即可作為基因復制擴增的場所，也可作為基因表達的場所；真核細胞一般用作基因表達系統。
一般將重組DNA分子導入原核細胞的過程稱為轉化（transformation），而將重組DNA分子導入真核細胞的過程稱為轉染（transfection）。
1、感受態細胞的制備
未經處理的大腸桿菌很難受納重組DNA分子，但當將大腸桿菌用物理或化學方法處理后，細胞對攝取外來DNA分子變得敏感了，這種經過處理而容易接受外源DNA分子的細胞叫做感受態細胞（competent cell）。
將重組DNA分子和感受態大腸桿菌細胞相混合，使DNA分子進入大腸桿菌細胞中，實現了重組DNA分子的轉化。
受體細胞是重組基因增殖的場所，對受體細胞也應具有幾個要求：
（1）容易接納重組DNA分子；（2）對載體的復制擴增無嚴格限制；（3）不存在特異的內切酶體系降解外源DNA；（4）不對外源DNA進行修飾。
由于載體的不同，所具備的篩選標志不同，所用的受體細胞也不同，因此可根據所用的載體選擇合適的受體細胞。
將大腸桿菌放入低滲的CaCl2溶液中，使細胞處于膨脹狀態，從而獲得大腸桿菌感受態細胞，4℃可保存1-2周，若需長期保存，可加甘油至終濃度為15%，置-70℃備用。
2、轉化
將重組質粒置于感受態細胞溶液中，使重組質粒吸附于感受態細胞的表面，冰浴一段時間，細胞膜處于收縮狀態。然后迅速將感受態細胞置于42℃，使細胞在熱環境中膜通道開放，重組質粒由膜外高濃度區向膜內擴散，經過45秒時間后，再將感受態細胞放回冰浴中，膜通道關閉，重組質粒轉入大腸桿菌。
3、轉化細胞的篩選和菌株的保存
（1）轉化細胞的篩選
作為載體的質粒都含有一種或兩種抗生素的耐藥基因，當把這種質粒轉入大腸桿菌后，此菌便獲得了抵抗這種抗生素的能力。目前分子克隆所用的克隆載體多含氨芐青霉素的耐藥基因，所以涉及最多的是氨芐青霉素篩選。當將氨芐青霉素加入培養基中后，只有含質粒的細菌能夠生存,而不含質粒的細菌則死亡。
另外，在某些質粒中含有LacZ基因，多克隆酶切位點位于LacZ基因內部，當沒有外源基因插入LacZ基因中時，LacZ基因的啟動子可使此基因編碼半乳糖甘酶，從而催化底物X-gal發生化學反應，菌落變成藍色；當外源基因與質粒發生連接時，LacZ基因失活，菌落呈白色，同時該質粒還含有氨芐青霉素耐藥基因，根據此特性，白色菌落含有重組質粒。
（2）質粒和菌株的保存
質粒可以在-20℃冰凍長期保存。
菌株可在含20-50%甘油培養液中-20℃或-70℃保存。