分子技術快速檢測食品有害微生物

食品污染大多數是因為病原微生物引起的，傳統的檢驗病原體的方法主要依靠具體的微生物學和生物化學免疫識別技術，比如培養基方法、分子生物學方法和免疫技術檢測，這些方法都能定量定性分析病原體，但它們耗時、花費大，且需要專業的技術人員。而新的分子技術如生物傳感器、微陣列、電子鼻子和納米裝置等能更快更準確地檢測食品中的病原體。

器和免疫芯片等。

Ｂｏｕｒｅｔｔｅ等將Ｅ．ｃｏｌｉ抗體共價固定在經戊二醛活化的有孔氨丙基玻璃珠上，構成ＦＩＡ免疫傳感器，用來檢測食品中的Ｅ．ｃｏｌｉ，其檢出限為５×１０７ＣＦＭ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ，檢測時間不到３０　ｍｉｎ，可重復使用３００次以上［３］。司士輝報道的利用壓電晶體免疫傳感器，通過蛋白Ａ將腸道細菌共同抗原的單克隆抗體包被在石英晶體表面，檢測晶體頻率的變化即可以檢測食物以及飲用水中許多腸道致病菌如大腸桿菌、沙門氏菌等［１］。

免疫傳感器已用于弗朗西斯氏菌、布魯士菌、奈瑟氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌等的檢測。１．２基因傳感器

基因傳感器就是把已知核苷酸序列的半單鏈ＤＮＡ分子固定在傳感器上（也稱ｓｓＤＮＡ探針），和另一條互補的ｓｓＤＮＡ（目標ＤＮＡ）雜交，形成雙鏈ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）后會表現出一定的物理信號，再通過換能器反應出來。

目前基因傳感器主要有電極電化學式基因傳感器、石英晶體振蕩器（ＱＣＭ）、質量式基因傳感器、光尋址式基因傳感器、場效應管式基因傳感器、表面等離子諧振（ＳＰＲ）光學式ＤＮＡ傳感器等［４］。

Ｕｒａｍａｔｓｕ等采用抗體壓電晶體生物傳感器測定大腸桿菌，檢測細菌下限為１０５個／ｍｌ。利用花菁與染色標記的單克隆抗Ｅ．ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７設計了一種便攜式光纖生物傳感器，可檢測Ｅ．ｃｏｌｉ　０１５７∶Ｈ７，檢測范圍３～３０ＣＦＵ／ｍｌ，具有高度專一性［２］。

基因傳感器使對目的ＤＮＡ測量時間大大縮短，且操作簡單、靈敏度高。

１生物傳感器（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）

生物傳感器是以生物化學和傳感技術為基礎，用酶、抗體、細胞等生物活性物質作為分子識別元件，配上信號轉換器和電子測量儀所構成的分析工具。樣品通過擴散作用進入分子識別元件，經分子識別，然后與分子識別元件發生特異性結合，其生物化學反應產生的生物學信息通過信號轉換器轉化為光信號或電信號，再通過儀表的放大和輸出，即達到檢測的目的。生物傳感器具有準確、靈敏、易操作和可重復使用等優點。

根據生物分子識別元件上的敏感物質可分為酶傳感器、微生物傳感器、組織傳感器、基因傳感器、免疫傳感器等。用于食品微生物檢測的主要是免疫傳感器、基因傳感器［１，２］。１．１免疫傳感器

免疫傳感器是用抗原或抗體作為分子識別部分，光纖及熒光計等作為信號轉換部分的生物傳感器，主要有：酶免疫傳感器、電化學免疫傳感器、光學免疫傳感器、壓電晶體免疫傳感器、表面等離子共振型免疫傳感

作者簡介：杜小琴（１９８２～　　），女，四川華鎣人，在讀碩士研究生，主要從事食品生物技術研究。

４０

中國食物與營養

２微陣列（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）

陣列是對事物的有序排列，根據樣品點的大小，陣列可分為大陣列（ｍａｃｒｏａｒｒａｙ）和微陣列（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。大陣列的樣品點直徑大于３００μｍ，一般用膠膜掃描儀來顯像檢測；而微陣列的樣品點直徑小于２００μｍ，必須用特定的自動儀和顯像設備來顯像檢測。由于微陣列的樣品點很小，因而單個微陣列可容納數千個甚至上萬個樣品，這樣就大大提高了檢測效率［５］。

目前微陣列有ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗體、蛋白質微陣列等，而ＤＮＡ微陣列用途最廣泛。ＤＮＡ微陣列是將載物玻璃片和膜上作為探針ＤＮＡ的寡聚核苷酸及ｃＤＮＡ，使其與熒光標記了的靶ＤＮＡ相雜交，再掃描顯像并測定雜交微陣列中各樣品點的熒光高度，最后統計分析所得數據。根據探針ＤＮＡ的特性，ＤＮＡ微陣列可分為：ｃＤＮＡ微陣列和寡聚核苷酸微陣列（ＰＮＡ微陣列），ｃＤＮＡ微陣列是用ｃＤＮＡ為探針，而ＰＮＡ微陣列是以寡聚核苷酸為探針［５］。

ＤＮＡ微排列已用于快速檢測病原細菌，如愛德華氏菌屬、亞硝化單胞菌［６］、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　０１５７∶Ｈ７、　Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｓｐｐ．［７］等。

數據分析系統。３．１樣品處理系統

樣品處理系統是從樣品中提取出不穩定化合物，是電子鼻子技術的關鍵。

樣品處理技術有：靜態頂部空間（ｓｔａｔｉｃ　ｈｅａｄｓｐａｃｅ，ＳＨＳ）、動態頂部空間（ｄｙｎａｍｉｃｈｅａｄｓｐａｃｅ，ＤＨＳ）、固相微提取（ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ　ｍｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＰＭＥ）、攪拌棒吸附提取（ｓｔｉｒ　ｂａｒ　ｓｏｒｐｔｉｖｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＢＳＥ）。具體選用哪種技術要考慮樣品的類型。３．２檢測系統

檢測系統是電子鼻子的主要部分，有兩種類型：固體氣敏元件（ｓｏｌｉｄ　ｓｔａｔｅ　ｇａｓ　ｓｅｎｓｏｒｓ）和質譜分析（ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＭＳ）。

氣敏元件電子鼻子基于不穩定化合物和固體氣敏元件的物理、化學反應，這些傳感器有廣的選擇性，高的敏感性、耐用性、穩定性，快的反應時間等優點。

質譜分析電子鼻子（ＭＳ）把不穩定化合物直接傳入內含質譜分析裝置的電離室，從同時進行的不穩定化合物破碎和電離過程中得到大量的光譜，每個碎離子都相當于一個傳感器，這樣質譜分析電子鼻子傳感器的數量比氣敏元件電子鼻子多，故質譜分析電子鼻子有多功能性，且穩定性和敏感性也高于氣敏元件電子鼻子。３．３數據分析系統

數據分析系統就是分析氣敏元件電子鼻子或質譜分析電子鼻子產生的信號［８］。

電子鼻子操作簡單且反應快，目前已廣泛用于食品檢測。如電子鼻子Ｂｌｏｏｄｈｏｕｎｄ　ＢＨ－１１４能檢測出食品中的枯草芽孢桿菌、青霉菌等［６］。

３電子鼻子（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　ｎｏｓｅ）

食品氣味是由數百種有不同感官和化學性質的不穩定有機化合物組成的，這些有機化合物數量的微妙變化決定了產品的氣味。并不是所有的不穩定化合物都有助于食品的氣味產生，一個化合物是否有助于產生氣味決定于它的濃度和感官極限（最小的濃度應被人的鼻子聞到）。濃度和感官極限的比率即為氣味活性值（ｏｄｏｒ　ａｃ－ｔｉｖｉｔｙ　ｖａｌｕｅ，ＯＡＶ），當化合物的ＯＡＶ值大于１時，就有助于產生食品的氣味。

很多產業評價食品氣味還是主要靠人的鼻子，當我們聞氣味時，先在鼻子里吸入不穩定化合物，不穩定化合物再和細胞膜上的受體蛋白反應，這一反應就會向大腦傳輸一個信號，從而大腦識別出氣味對應的特殊分子。但人的鼻子鑒定需要專業訓練人員，而且還受到人對氣味反應的主觀性和個體差異的影響。

電子鼻子實際上是一個電子嗅覺系統，它模仿人類鼻子接受器而制成的，有許多傳感器。它的基本原理是樣品中的不穩定化合物和大量氣體傳感器起反應，接下來，再分析鑒定樣品的化學組成，達到檢測的目的。 一個電子鼻子包括三部分：樣品處理系統、檢測系統、

４納米裝置（Ｎａｎｏ－ｄｅｖｉｃｅ）

納米裝置就是根據納米粒子的特殊性質，把納米粒子用于標記物的檢測裝置。

納米（ｎａｎｏｍｅｔｅｒ，ｎｍ）是一個長度單位，當物體的尺度小到納米尺度時，就會表現與宏觀尺度物質不同的性能特點，稱為納米效應［９］。納米效應如小尺寸效應、表面效應和量子尺寸效應導致它們可作為生物分析的標記物質，且能大大改善標記物的性能，顯著提升靈敏度。用于生物分析的納米粒子標記物按材料可分為金屬納米粒子、半導體納米粒子、復合型納米粒子［１０，１１］。４．１金屬納米粒子

金屬納米粒子有納米金、納米銀等，最常見的是納

杜小琴等：分子技術快速檢測食品有害微生物４１

米金粒子，它具有良好的穩定性，由氯金酸氧化還原制成。納米金對許多生物大分子都有很強的吸附作用，而且吸附后不會使生物分子變性，其顏色依直徑大小而呈紅色至紫色，根據這一性質把納米金用于標記物，可以達到檢測的目的。４．２半導體納米粒子

半導體納米粒子也稱量子點或半導體納米晶，它是由半導體材料制成的納米晶體，尺寸在２～２０ｎｍ之間，常見的有ＺｎＳ、ＣｄＳ、ＰｂＳ等，它是將半導體量子點與生物識別分子結合，用于成像或作為生物反應過程的標記。

４．３復合型納米粒子

復合型納米粒子是指用高分子材料包裹熒光分子或發光分子形成的納米粒子。如包裹著若干個染料分子的熒光納米球、包含著稀土螯合物的納米粒子，這種包裹作用一方面能使更多的發光分子連接在生物分子上起到信號放大作用，另一方面可克服外界環境對發光試劑的影響，增加發光試劑的穩定性。

納米粒子與待測ＤＮＡ偶聯后，其納米粒子標記物的檢測方法主要有分光光度法、熒光分析法和電化學分析法。分光光度法是根據納米粒子標記ＤＮＡ探針在分子雜交反應前后最大吸收波長的變化進行測定；熒光分析法是根據不同納米粒子能被單一波長的光激發而發出不同顏色的不易降解的光，實現對納米標記物的測定；電化學分析法是通過納米粒子標記物中金屬含量的測定，達到對納米粒子標記物的測定。納米裝置能檢測食品中大量的病原體，已用于檢測大腸桿菌Ｅ．ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７［６］。

還存在檢測干擾物和生物分子穩定性等問題，需要進一步改進和完善。