雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細胞總DNA或總RNA。
根據使用的方法被檢測的核酸可以是提純的，也可以在細胞內雜交, 即細胞原位雜交。
探針必須經過標記，以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標記物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年來發展了許多非同位素標記探針的方法,多使用甾類化合物地高辛配基（digoxigenin，DIG）標記。
