第二節T7 DN A 聚合酶測序技術
一、概述
T7 DNA
聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及單鏈和雙鏈3'→5'外切酶活性。當T7 DNA
聚合酶用適當方法處理后，可使3'→5'外切酶活力明顯下降。改造后的T7 DNA 聚合酶又稱T7 測序酶。使用T7
測序酶得到的測序數據具有在每個堿基位置都有相對均勻的配對參入。因此, 放射自顯影所得到的結果較為清晰易辯, 對于許多模板來說, 使用含有dGTP
的混合物即可得到理想的測序結果。然而, 如果出現了帶壓縮的問題，則用含dITP 的混合物來取代常規的dGTP。dITP 的摻入，使在富含GC
的模板中也能有效地消除帶壓縮現象。
T7 測序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延續性，正因如此，該酶在使用中不同于Klenow
片段和反轉錄酶。它幾乎沒有錯誤性的終止，整個反應在很短的時間內完成，并且不需要進行追加反應(Chase
step)。然而對于有緊密二級結構的區域, 錯誤的終止反應會給閱讀序列帶來困難。如果碰到這些情況，應使用一些高溫DNA 聚合酶，如Promega
公司的測序級Taq DNA 酶。利用高溫DNA 聚合酶獨有的耐熱特性，測序反應可在不利于形成二級結構的高溫條件下進行。T7 DNA
聚合酶測序的快速而簡便的方法是從Klenow 酶和AMV 反轉錄酶測序的操作步驟修改而來的，它的最大優點是具有很高的5'-3'的DNA
合成活性和極低的3'-5'端外切酶的活性。在測序過程中，若以同位素標記則相對于大腸桿菌DNA 聚合酶Ⅰ的大片段Klenow，或反轉錄酶AMV
而言，則可使條帶非常的均一，并且它的放射性背景極低。T7 DNA 聚合酶測序時DNA
的合成的過程是分二步完成的。第一步為標記反應階段，第二步方為雙脫氧鏈末端終止的DNA
合成過程。在第一步過程，引物的延伸是在較低濃度的脫氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反應過程中，已含有經放射性標記的dATP。第二步過程中，脫氧三磷酸核苷酸濃度提高，并且加入雙脫氧的三磷酸核苷酸，DNA
在合成過程中，因加入的雙脫氧三磷酸核苷酸而隨機終止，形成長短不一的DNA 片段。
二、材料待測的DNA 模板，可用雙鏈或單鏈模板。
三、設備高壓電泳儀，測序用電泳槽，照相顯影用大號塑料盆，制膠設備，吹風機，放射自顯影盒，X-光片。
四、試劑
1、5×T7 DNA 聚合酶緩沖液：200mmol/L Tris?Cl, pH7.5, 100mmol/L MgCl2, 250mmol/L NaCl。
2、引物：使用通用引物pUC/M13 正向或逆向引物。
3、DTT ： 0.1mol/L。
4、5×常規標記混合物：7.5mmol/L dGTP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。
5、5×dITP 標記混合物：15mmol/L dITP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。
6、dNTP A 溶液（適用于dGTP): 80mmol/L dGTP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/LdTTP, 50mmol/L NaCL。
7、ddG 終止混合物(適用于dGTP)：dNTP A 溶液再加8mmol/L ddGTP。
8、ddA 終止混合物(適用于dGTP)：dNTP A 溶液再加8mmol/L ddATP。
9、ddT 終止混合物(適用于dGTP)：dNTP A 溶液再加8mmol/L ddTTP。
10、ddC 終止混合物(適用于dGTP)：dNTP A 溶液再加8mmol/L ddCTP。
11、dNTP B 溶液（適用于dITP): 160mmol/L dITP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/LdTTP, 50mmol/L NaCl。
12、ddG 終止混合物(適用于dITP)：dNTP B 溶液再加1.6mmol/L ddGTP。
13、ddA 終止混合物(適用于dITP)：dNTP B 溶液再加1.6mmol/L ddATP。
14、ddT 終止混合物(適用于dITP)：dNTP B 溶液再加1.6mmol/L ddTTP。
15、dd C 終止混合物(適用于dITP)：dNTP B 溶液再加1.6mmol/L ddCTP。
16、測序用T7 DNA 測序酶。
17、酶稀釋緩沖液：10mmol/L Tris?HCl, pH7.5, 5mmol/L DTT, 0.5mg/ml BSA 。
18、終止溶液： 95%甲酰胺，20mmol/L EDTA, 0.05%溴酚蘭，0.05%二甲苯蘭。
19、[a-32P]dATP 或[a-35S]-dATP, 35S 的優點是可使條帶為窄而清晰，并且操作更為安全。放射強度為：1000-1500Ci/mmol，10mCi/ml。
20、TE 緩沖液：10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA, pH7.5。
21、上節所述的凝膠制備過程中的全套試劑。
22、X 光顯影液：H2O：50℃ 800ml，米吐爾2.2g，無水Na2SO3 72g，對苯二酚8.8g，無水NaCO3 48g , KBr 4g， 定容至1000ml 備用。
23、F-5 堅膜定影液：水600ml , Na2S2O3 240g, Na2SO3 15g, 冰醋酸13.4ml；硼酸7.5g ，粉狀鉀礬15g ，定容至1000ml 備用。
24、TYP 肉汁培養基：16g 蛋白胨，16g 酵母提取物，5g NaCl, 2.5g K2HPO4，加水溶解，定容至1000ml。
25、20%PEG/3.75mol NH4Ac 溶液：40% PEG（分子量8000）儲備液和7.5mol/L pH7.2 NH4Ac儲備液等體積混合。
五、操作步驟：
（一）、模板制備
1、M13
單鏈模板制備：在轉化入合適的大腸桿菌宿主菌且在含有指示劑如X-gal/IPTG 的培養基上鋪板之后, 含有M13
重組子的細胞將表現出無色的"噬菌斑"，事實上受感染的細胞并非被噬菌體溶菌或殺死，出現噬菌斑是因為被感染的細菌在生長速度上比其周圍未感染的細菌慢的緣故,
從無色噬菌斑上得到的感染細胞經培養便能產生測序反應所需的單鏈模板。
（1）過夜培養的宿主細胞(如NM522 或JM101)用3ml TYP 肉汁培養基以1:100 稀釋。在37℃強烈震蕩1 小時之后, 細胞進入對數早期。此時, 將一個合適的含有重組M13 的噬菌斑(連同瓊脂)用滴管轉入該細胞培養液中。
（2）37℃強烈震蕩(300rpm) 培養6 小時。
（3）把細胞培養液轉入兩只1.5ml eppendorf 管, 12000g 離心15 分鐘。上清液轉移到新的eppendorf 管再離心15 分鐘。小心地取出1-1.2ml 上清液(注意不能觸及沉淀), 再轉到新的eppendorf管。.
（4）將0.25
體積的含20％PEG(-8000)的3.75M 醋酸銨(pH7.5)加入上清液以沉淀噬菌體。混勻后置冰上30 分鐘, 再以12000g
離心15 分鐘, 傾去上清液, 再以同樣方法離心一次, 用吸液器尖頭將殘留的PEG 充分吸干凈。此時應能見管底有芝麻大小的噬菌體顆粒沉淀。
（5）將沉淀物重溶于400ml TE 緩沖液中。
（6）加等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合液, 強烈震蕩1 分鐘，12000g 離心5 分鐘。
（7）將水相轉入一新的eppendorf 管, 注意不能觸動原管中兩相交界面。加等體積苯酚/氯仿(1:1)混合液, 強烈振蕩1 分鐘, 12000g 離心5 分鐘。
（8）將上層水相轉入另一新的eppendorf 管, 重復第7 步的提取, 如有必要重復多次直至二相之間無可見物質存在。
（9）將上層水相轉入一新的eppendorf 管, 加等體積氯仿, 強烈振蕩1 分鐘后, 12000g 離心5分鐘, 多次重復此步驟。
（10）將上層水相轉入新的eppendorf 管, 加0.5 倍體積的7.5 mol/L 醋酸銨, 2 倍體積乙醇, 混勻后-20℃放置30 分鐘。
（11）12000g 離心15 分鐘, 去除上清液, 用70％乙醇小心清洗沉淀, 如果沉淀已被攪起, 重新離心, 傾去酒精, 真空干燥沉淀物。
（12）將DNA 的沉淀物溶解于20ml 去離子水中，取2ml 樣品進行瓊脂糖凝膠電泳定量, 如果DNA 量充足, 則可進行退火測序。
2、噬粒(Phagemid)單鏈模板的制備：
噬粒是指含有絲狀單鏈DNA 噬菌體復制區的嵌合質粒。分子克隆中常用的pBluescript 系列和pGEM系列的質粒均屬噬粒。含重組噬粒的細胞單菌落經液體培養并用輔助噬菌體超感染后就能產生測序反應所需的單鏈DNA 模板。
（1）從新鮮平板上挑得含pGEM 質粒DNA 的抗Amp 單菌落, 并接種到100ml 含有50mg/ml氨芐的TYP 肉湯培養基中, 在37℃振蕩過夜。
（2）取100ml 過夜培養物接種到另一新的裝有5ml 含50mg/mlAmp 的TYP 肉汁培養基的試管中, 在37℃強烈振蕩30 分鐘。
（3）加40μl 輔助噬菌體R408 或M13 K07, 繼續劇烈攪拌振蕩培養6-8 小時，使輔助噬菌體超感染。
（4）12000g 離心15 分鐘后，去除沉淀，取上清，轉移到一新eppendorf 管中再次離心15分鐘.