第三講 蛋白質合成
一.基因與基因表達的一般概念
基因作為唯一能夠自主復制、永久存在的單位，其生理學功能以蛋白質形式得到表達。DNA序列是遺傳信息的貯存者，它通過自主復制得到永存，并通過轉錄生成mRNA，翻譯生成蛋白質的過程控制所有生命現象。
編碼鏈（coding strand）又稱sense strand，是指與mRNA序列相同的那條鏈。非編碼鏈（anticoding strand），又稱antisense strand，是指那條根據堿基互補原則指導mRNA生物合成的DNA鏈。
Genetic
information is perpetuated by replication（復制）in which a double-
stranded nucleic acid is duplicated to give identical copies.
基因表達包括轉錄（transcription）和翻譯（translation）兩個階段。轉錄是指拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同（除了T→U之外）的RNA單鏈的過程，是基因表達的核心步驟。翻譯是指以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯子遺傳密碼翻譯成氨基酸序列、合成蛋白質多肽鏈的過程，是基因表達的最終目的。
只有mRNA所攜帶的遺傳信息才被用來指導蛋白質生物合成，所以人們一般用U、C、A、G這4種核苷酸而不是T、C、A、G的組合來表示遺傳性狀。所謂翻譯是指將mRNA鏈上的核苷酸從一個特定的起始位點開始，按每3個核苷酸代表一個氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過程。
二. 遺傳密碼——三聯子
mRNA上每3個核苷酸翻譯成蛋白質多肽鏈上的一個氨基酸，這3個核苷酸就稱為一個密碼，也叫三聯子密碼。翻譯時從起始密碼子AUG開始，沿mRNA5’→3’的方向連續閱讀直到終止密碼子，生成一條具有特定序列的多肽鏈。
mRNA中只有4種核苷酸，而蛋白質中有20種氨基酸，若以一種核苷酸代表一種氨基酸，只能代表4種(41=4)。若以兩種核苷酸作為一個密碼（二聯子），能代表42=16種氨基酸。而假定以3個核苷酸代表一個氨基酸，則可以有43=64種密碼，滿足了編碼20種氨基酸的需要。
50-60年代破譯遺傳密碼方面的三項重要成果：
（1）Paul Zamecnik等人證實細胞中蛋白質合成的場所。他們把放射性標記的氨基酸注射到大鼠體內，經過一段時間后收獲其肝臟，進行蔗糖梯度沉淀并分析各種細胞成份中的放射性蛋白質。
如果注射后經數小時（或數天）收獲肝臟，所有細胞成份中都帶有放射性標記的蛋白質;
如果注射后幾分鐘內即收獲肝臟，那么，放射性標記只存在于含有核糖體顆粒的細胞質成份中。
（2）Francis Crick等人第一次證實只有用三聯子密碼的形式才能把包含在由AUGC四個字母組成遺傳信息（核酸）準確無誤地翻譯成由20種不同氨基酸組成的蛋白質序列，實現遺傳信息的表達。
實驗1:
用吖啶類試劑（誘導核苷酸插入或丟失）處理T4噬菌體rII位點上的兩個基因，使之發生移碼突變（frame-shift），就生成完全不同的、沒有功能的蛋白質。
實驗2:
研究煙草壞死衛星病毒發現，其外殼蛋白亞基由400個氨基酸組成，相應的RNA片段長1200個核苷酸，與密碼三聯子體系正好相吻合。
實驗3:
以均聚物為模板指導多肽的合成。 在含有tRNA、核糖體、AA-tRNA合成酶及其它蛋白質因子的細胞抽提物中加入mRNA或人工合成的均聚物作為模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分時又能合成新的肽鏈，新生肽鏈的氨基酸順序由外加的模板來決定。
1961年，Nirenberg等以poly（U）作模板時發現合成了多聚苯丙氨酸，從而推出UUU代表苯丙氨酸（Phe）。以poly（C）及poly（A）做模板分別得到多聚脯氨酸和多聚賴氨酸。
實驗4:
以特定序列的共聚物為模板指導多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2個氨基酸組成的多肽，
5'…UGU GUG UGU GUG UGU GUG…3',不管讀碼從U開始還是從G開始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）兩種密碼子。
實驗5:
以共聚三核苷酸作為模板可得到有3種氨基酸組成的多肽。如以多聚（UUC）為模板，可能有3種起讀方式：
5’…UUC UUC UUC UUC UUC…3’或 5’…UCU UCU UCU UCU UCU…3’或 5'…CUU CUU CUU CUU CUU…3'分別產生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）.
多聚三核苷酸為模板時也可能只合成2種多肽：5’…GUA GUA GUA GUA GUA…3’或5’…UAG UAG UAG UAG UAG…3’
或5’…AGU AGU AGU AGU AGU…3’由第二種讀碼方式產生的密碼子UAG是終止密碼，不編碼任何氨基酸，因此，只產生GUA（Val）或AGU（Ser）。
實驗6:
以隨機多聚物指導多肽合成。Nirenberg等及Ochoa等又用各種隨機的多聚物作模板合成多肽。例如，以只含A、C的多聚核苷酸作模板，任意排列時可出現8種三聯子，即CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、AAC、AAA，獲得由Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys等6種氨基酸組成的多肽。
（3）氨基酸的“活化”與核糖體結合技術。
如果把氨基酸與ATP和肝臟細胞質共培養，氨基酸就會被固定在某些熱穩定且可溶性RNA分子（transfer
RNA，tRNA）上。現將氨基酸活化后的產物稱為氨基酰-tRNA（aminoacyl-tRNA），并把催化該過程的酶稱為氨基酰合成酶（aminoacyl-tRNA
Synthetase）。
以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等為模板，在含核糖體、AA-tRNA的反應液中保溫后通過硝酸纖維素濾膜，只有游離的AA-tRNA因相對分子質量小而通過濾膜，而核糖體或與核糖體結合的AA-tRNA則留在濾膜上，這樣可把已結合與未結合的AA-tRNA分開。
當體系中帶有多聚核苷酸模板時，從大腸桿菌中提取的核糖體經常與特異性氨基酰-tRNA相結合。如果把核糖體與poly（U）和Phe-tRNAPhe共溫育，核糖體就能同時與poly（U）和Phe-tRNAPhe相結合。
4種核苷酸組成61個編碼氨基酸的密碼子和3個終止密碼子，它們不能與tRNA的反密碼子配對，但能被終止因子或釋放因子識別，終止肽鏈的合成。由一種以上密碼子編碼同一個氨基酸的現象稱為簡并（degeneracy），對應于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonymous
codon）。
三．密碼子和反密碼子的相互作用
蛋白質生物合成過程中，tRNA的反密碼子通過堿基的反向配對與mRNA的密碼子相互作用。1966年，Crick根據立體化學原理提出擺動假說（wobble hypothesis），解釋了反密碼子中某些稀有成分如I以及許多有2個以上同源密碼子的配對問題。
Wobble hypothesis
① 任意一個密碼子的前兩位堿基都與tRNA anticodon中的相應堿基形成Watson-Crick堿基配對。
② 反密碼子第一位是A或C時，只能識別一個密碼子。當反密碼子第一位是U或G時，能識別兩個密碼子。當Inosine（I）作為反密碼子第一位時，能識別三個密碼子。
③ 如果數個密碼子同時編碼一個氨基酸，凡是第一、二位堿基不相同的密碼子都對應于各自的tRNA。
④ 根據上述規則，至少需要32種不同的tRNA才能翻譯61個密碼子。
四．tRNA
tRNA在蛋白質合成中處于關鍵地位，被稱為第二遺傳密碼。它不但為將每個三聯子密碼翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準確無誤地將所需氨基酸運送到核糖體上提供了載體。所有的tRNA都能夠與核糖體的P位點和A位點結合，此時，tRNA分子三葉草型頂端突起部位通過密碼子：反密碼子的配對與mRNA相結合，而其3’末端恰好將所轉運的氨基酸送到正在延伸的多肽上。代表相同氨基酸的tRNA稱為同工tRNA。在一個同工tRNA組內，所有tRNA均專一于相同的氨基酰-
tRNA合成酶。
1、tRNA的三葉草型二級結構
受體臂（acceptor
arm）主要由鏈兩端序列堿基配對形成的桿狀結構和3’端末配對的3-4個堿基所組成，其3’端的最后3個堿基序列永遠是CCA，最后一個堿基的3’或2’自由羥基（—OH）可以被氨酰化。TφC臂是根據3個核苷酸命名的，其中φ表示擬尿嘧啶，是tRNA分子所擁有的不常見核苷酸。反密碼子臂是根據位于套索中央的三聯反密碼子命名的。D臂是根據它含有二氫尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。
最常見的tRNA分子有76個堿基，相對分子質量約為2.5×104。不同的tRNA分子可有74-95個核苷酸不等，tRNA分子長度的不同主要是由其中的兩條手臂引起的。tRNA的稀有堿基含量非常豐富，約有70余種。每個tRNA分子至少含有2個稀有堿基，最多有19個，多數分布在非配對區，特別是在反密碼子3'端鄰近部位出現的頻率最高，且大多為嘌呤核苷酸。這對于維持反密碼子環的穩定性及密碼子、反密碼子之間的配對是很重要的。
2．tRNA的L形三級結構
酵母和大腸桿菌tRNA的三級結構都呈L形折疊式。這種結構是靠氫鍵來維持的，tRNA的三級結構與AA- tRNA合成酶的識別有關。受體臂和TφC臂的桿狀區域構成了第一個雙螺旋，D臂和反密碼子臂的桿狀區域形成了第二個雙螺旋。
tRNA的L形高級結構反映了其生物學功能，因為它上所運載的氨基酸必須靠近位于核糖體大亞基上的多肽合成位點，而它的反密碼子必須與小亞基上的mRNA相配對，所以兩個不同的功能基團最大限度分離。
3．tRNA的功能
轉錄過程是信息從一種核酸分子（DNA）轉移至另一種結構上極為相似的核酸分子（RNA）的過程，信息轉移靠的是堿基配對。翻譯階段遺傳信息從mRNA分子轉移到結構極不相同的蛋白質分子，信息是以能被翻譯成單個氨基酸的三聯子密碼形式存在的，在這里起作用的是解碼機制。
4．tRNA的種類
（1）起始tRNA和延伸tRNA
能特異地識別mRNA模板上起始密碼子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA統稱為延伸tRNA。原核生物起始tRNA攜帶甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA攜帶甲硫氨酸（Met）。
（2）同工tRNA
代表同一種氨基酸的tRNA稱為同工tRNA，同工tRNA既要有不同的反密碼子以識別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結構上的共同性，能被AA- tRNA合成酶識別。
（3）校正tRNA
校正tRNA分為無義突變及錯義突變校正。
在蛋白質的結構基因中，一個核苷酸的改變可能使代表某個氨基酸的密碼子變成終止密碼子（UAG、UGA、UAA），使蛋白質合成提前終止，合成無功能的或無意義的多肽，這種突變就稱為無義突變。
五．AA- tRNA合成酶 是一類催化氨基酸與tRNA結合的特異性酶，其反應式如下：
它實際上包括兩步反應：
第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸復合物。
AA+ATP+酶（E）→E-AA-AMP+PPi
第二步是氨酰基轉移到tRNA 3’末端腺苷殘基上，與其2’或3’-羥基結合。
E-AA-AMP+ tRNA→AA- tRNA +E+AMP
蛋白質合成的真實性主要決定于AA-
tRNA合成酶是否能使氨基酸與對應的tRNA相結合。AA-tRNA合成酶既要能識別tRNA，又要能識別氨基酸，它對兩者都具有高度的專一性。不同的tRNA有不同堿基組成和空間結構，容易被tRNA合成酶所識別，困難的是這些酶如何識別結構上非常相似的氨基酸。
有兩道關口:
The first filter is the initial binding of the amino acid to the enzyme and its activation to aminoacyl-AMP.
The second filter is the binding of incorrect aminoacyl-AMP products to a separate active site on the enzyme.
核糖體像一個能沿mRNA模板移動的工廠，執行著蛋白質合成的功能。它是由幾十種蛋白質和幾種核糖體RNA（ribosomal
RNA，rRNA）組成的亞細胞顆粒。一個細菌細胞內約有20000個核糖體，而真核細胞內可達106個，在未成熟的蟾蜍卵細胞內則高達1012。核糖體和它的輔助因子為蛋白質合成提供了必要條件。
1.核糖體的組成
原核生物核糖體由約2/3的RNA及1/3的蛋白質組成。真核生物核糖體中RNA占3/5，蛋白質占2/5。核糖體是一個致密的核糖核蛋白顆粒，可以解離為兩個亞基，每個亞基都含有一個相對分子質量較大的rRNA和許多不同的蛋白質分子。
大腸桿菌核糖體小亞基由21種蛋白質組成，分別用S1……S21表示，大亞基由33種蛋白質組成，分別用L1……L33表示。真核生物細胞核糖體大亞基含有49種蛋白質，小亞基有33種蛋白質。
2、rRNA
3.核糖體的功能
核糖體包括至少5個活性中心，即mRNA結合部位、結合或接受AA-
tRNA部位（A位）、結合或接受肽基tRNA的部位、肽基轉移部位（P位）及形成肽鍵的部位（轉肽酶中心），此外還有負責肽鏈延伸的各種延伸因子的結合位點。小亞基上擁有mRNA結合位點，負責對序列特異的識別過程，如起始位點的識別和密碼子與反密碼子的相互作用。大亞基負責氨基酸及tRNA攜帶的功能，如肽鍵的形成、AA-
tRNA、肽基- tRNA的結合等。A位、P位、轉肽酶中心等主要在大亞基上。
核糖體可解離為亞基或結合成70S/80S顆粒。翻譯的起始階段需要游離的亞基，隨后才結合成70S/80S顆粒，繼續翻譯進程。體外反應體系中，核糖體的解離或結合取決于Mg2+離子濃度。在大腸桿菌內，Mg2+濃度在10-3mol/L以下時，70S解離為亞基，濃度達10-2mol/L時則形成穩定的70S顆粒。細胞中大多數核糖體處于非活性的穩定狀態，單獨存在，只有少數與mRNA一起形成多聚核糖體。它從mRNA的5'末端向3'末端閱讀密碼子，至終止子時合成一條完整的多肽鏈。mRNA上核糖體的多少視mRNA的長短而定，一般40個核苷酸有一個核糖體。
七. 信使核糖核酸
mRNA messenger ribonucleic acidDNA deoxyribonucleic acid.
雖然mRNA在所有細胞內執行著相同的功能，即通過三聯子密碼翻譯生成蛋白質，其生物合成的具體過程和成熟mRNA的結構在原核和真核生物細胞內是不同的。
八、蛋白質的生物合成
核糖體是蛋白質合成的場所，mRNA是蛋白質合成的模板，tRNA是模板與氨基酸之間的接合體。此外，有20種以上的AA-tRNA及合成酶、10多種起始因子、延伸因子及終止因子，30多種tRNA及各種rRNA、mRNA和100種以上翻譯后加工酶參與蛋白質合成和加工過程。
蛋白質合成消耗了細胞中90%左右用于生物合成反應的能量。細菌細胞中的2萬個核糖體，10萬個蛋白質因子和20萬個tRNAs 約占大腸桿菌干重的35%。
在大腸桿菌中合成一個100個氨基酸的多肽只需5分鐘。
1.蛋白質生物合成的主要步驟：
翻譯的起始——核糖體與mRNA結合并與氨基酰-tRNA生成起始復合物。肽鏈的延伸——核糖體沿mRNA5’端向3’端移動，導致從N端向C端的多肽合成。肽鏈的終止以及肽鏈的釋放——核糖體從mRNA上解離，準備新一輪合成反應。
主要分為五步
1、 Activation of Amino Acids (This reaction takes place in the cytosol, not on the ribosome).
2、
Initiation. The mRNA bearing the code for the polypeptide binds to the
small ribosomal subunit and to the initiating aminoacyl-tRNA.
3、Elongation. Peptide bonds are formed in this stage.
4、Termination and Release. Completion of the polypeptide chain is signaled by a termination codon in the mRNA.
5、Folding and Post translational Processing.
肽鏈延伸分為三步
① Binding of an incoming aminoacyl-tRNA.
② Peptide bond formation.
③ Translocation.
2.與蛋白質合成有關的因子
起始因子Initiation
factor（IF）延伸因子Elongation factor（EF）終止因子。原核中有RF1-3。RF-1 識別 UAA和UAG; RF-2
識別 UAA和UGA; RF-3 僅能促進RF-1和RF-2的功能。終止因子行使功能時需要GTP。真核生物中只有一個RF，能識別3個終止子。
3、蛋白質合成的起始
蛋白質合成的起始復合物:
30S 核糖體小亞基
模板mRNA
fMet-tRNAfMet
起始因子
GTP
50S 核糖體大亞基
Mg2+
合成的起始可分為三步:
1、30S 核糖體小亞基與起始因子IF –1和IF-3相結合，誘發模板mRNA與小亞基結合。
2、由30S 小亞基、起始因子IF –1和IF-3及模板mRNA所組成的復合物立即與GTP-IF-2及fMet-tRNAfMet相結合。反密碼子與密碼子配對。
3、上述六組分復合物再與50S大亞基結合，水解GTP生成并釋放GDP和Pi。釋放三個起始因子。
表27-9 真核細胞中參與翻譯起始的蛋白質因子及其功能
真核因子 功能
eIF2 促進Met-tRNAMet與核糖體40S小亞基結合。
eIF2B
eIF3
是最早與核糖體40S小亞基結合的促進因子，蛋白質合成反應的正常進行。
eIF4A 具有RNA解旋酶活性，解除mRNA模板的次級結構并使之與40S小亞基結合，形成eIF4F復合物。
eIF4B 與mRNA模板相結合，協助核糖體掃描模板序列，定位AUG。
eIF4E 與mRNA 5'的帽子結構相結合，形成eIF4F復合物。
eIF4G 與eIF4E和poly（A）結合蛋白（PAB）相結合，形成eIF4F復合物。
eIF5 促使多個蛋白因子與40S小亞基解體，以此幫助大小亞基結合形成80核糖體，形成翻譯起始復合物。
eIF6 促進沒有蛋白質合成活性的80S核糖體解離成40S和60S兩個亞基。
4、肽鏈的延伸
肽鏈延伸的基本要求是 ：
有完整的起始復合物，
有氨基酰-tRNA，
有延伸因子EF-Tu, EF-Ts和EF-G，
有GTP。
肽鏈延伸也可被分為三步：
第一步，與新進來的氨基酰-tRNA相結合。氨基酰-tRNA首先必須與GTP-EF-Tu復合物相結合，形成氨基酰-tRNA-GTP-EF-Tu復合物并與70S中的A位點相結合。此時，GTP水解并釋放GDP-EF-Tu復合物。
第二步，肽鍵形成。
肽鍵形成之初，兩個氨基酸仍然分別與各自的tRNA相結合，仍然分別位于A位點和P位點上。A位點上的氨基酸（第二個氨基酸）中的α-氨基作為親核基團取代了P位點上的tRNA，并與起始氨基酸中的COOH基團形成肽鍵。本反應可能由peptidyl
transferase 催化。
第三步，移位（translocation）。
核糖體向mRNA的3’方向移動一個密碼子，使得帶有第二個氨基酸（現已成為二肽）的tRNA從A位進入P位，并使第一個tRNA從P位進入E位。此時模板上的第三個密碼子正好在A位上。核糖體的移位需要EF-G（translocase）和另一分子GTP水解提供能量。
5、肽鏈的終止
當終止密碼子進入核糖體A位點時，在釋放因子RF1-3的作用下：
（1）水解末端肽基tRNA；
（2）釋放新生肽和tRNA；
（3）使70S核糖體解離成30S和50S兩個亞基。
6、蛋白質合成的抑制劑
抗菌素對蛋白質合成的作用可能是阻止mRNA與核糖體結合（氯霉素），或阻止AA-tRNA與核糖體結合（四環素類），或干擾AA-tRNA與核糖體結合而產生錯讀（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等），或作為競爭性抑制劑抑制蛋白質合成。
鏈霉素是一種堿性三糖，干擾fMet-tRNA與核糖體的結合，從而阻止蛋白質合成的正確起始，并導致mRNA的錯讀。若以poly（U）作模板，則除苯丙氨酸（UUU）外，異亮氨酸（AUU）也會摻入。對鏈霉素敏感位點在30S亞基上。
嘌呤霉素是AA-tRNA的結構類似物，能結合在核糖體的A位上，抑制AA-tRNA的進入。它所帶的氨基與AA- tRNA上的氨基一樣，能與生長中肽鏈上的羧基生成肽鍵，這個反應的產物是一條3'羧基端掛了一
嘌呤霉素。
青霉素、四環素和紅霉素只與原核細胞核糖體發生作用，從而阻遏原核生物蛋白質的合成，抑制細菌生長。氯霉素和嘌呤霉素既能與原核細胞核糖體結合，又能與真核生物核糖體結合，妨礙細胞內蛋白質合成，影響細胞生長。因此，前3種抗生素被廣泛用于人類醫學，后兩種則很少在醫學上使用。