1. DNA復制的起始
大腸桿菌中的復制起始位點是Ori C，全長245Bp，該序列在所有細菌復制起始位點中都是保守的。
DNA復制起始中的主要步驟
a. 大約20個左右的DnaA蛋白首先與OriC中的4個9堿基重復區相結合；
b. 識別并使3個13堿基串聯重復區DNA形成開環結構；
c. DnaB蛋白在DnaC的幫助下與未解鏈序列結合。每六個DnaB蛋白形成一組并與一條DNA母鏈結合，可在不同方向同時起始DNA的復制。當細胞中存在足夠的SSB和DNA gyrase時，DnaB的解鏈效率非常高。
整個DNA復制過程中，只有復制起始受細胞周期的嚴格調控。
"Once in each cell cycle。"
DNA甲基化與DNA復制起始密切相關。OriC中有11個GATC回文結構（一般說來，256bp才應有一個GATC重復）。DNA子鏈被合成后，母鏈立即被甲基化（稱為hemimethylated）。此時，oriC與細胞原生質膜相結合。只有當oriC被從膜上釋放出來，子鏈被Dam甲基化后，才能有效地與DnaA蛋白結合，起始新一輪的DNA復制。復制起始可能還受ATP水解過程調控，因為DnaA只有與ATP相結合時才能與oriC區DNA相結合。
2. DNA子鏈的延伸
主要包括兩個不同但相互有聯系的事件，即前導鏈和滯后鏈的合成。由DNA helicase解開雙螺旋，由拓樸異構酶消除DNA鏈上的扭曲力，SSB結合使DNA單鏈穩定。
前導鏈的合成：由DnaG（primase）在復制起始位點附近合成一個10-60 nt的RNA引物，然后由polII把dNTP加到該引物上。
滯后鏈的合成：產生Okazaki fragments，消除RNA引物并由DNA pol I補上這一小段DNA序列，由DNA Ligase把兩個片段相連。
3. DNA鏈的終止
當子鏈延伸達到terminus
region（ter，帶有多個20bp序列）時，DNA復制就終止了。Ter有點像一個陷井（trap），使復制叉只能進入，不能出來。Ter的功能主要是由Ter-Tus復合物（ter
utilization substance）來完成的。
4. 真核細胞DNA的復制比大腸桿菌更復雜
真核生物的origin
of replication被稱為ARS-autonomously replicating
sequences或者被稱為replicators。Yeast
replicators長約150dp，有多個保守重復區，共有約500個replicators分布于酵母的17條染色體中。
㈡、DNA的損傷修復
1． 錯配修復（mismatch Repair）
錯配修復對DNA復制忠實性的貢獻力達102-103，DNA子鏈中的錯配幾乎完全都被修正，充分反映了母鏈的重要性。
2. 堿基切除修復（Base-Excision Repair）
DNA
gylcosylases能特異性識別常見的DNA損傷（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨酰化產物）并將受損害堿基切除。去掉堿基后的核苷酸被稱為AP位點（apurinic
or apyrimidinic）。細胞中最常見的Uracil Glycosylase就能特異性切除細胞中的去氨基胞嘧啶。
3. 核苷酸切除修復（nucleotide-excision repair）
當DNA鏈上相應位置的核苷酸發生損傷，導致雙鏈之間無法形成氫鍵，由核苷酸切除修復系統負責進行修復。
4.DNA的直接修復（Direct repair）
㈢、DNA的轉座
DNA的轉座，或稱移位（transposition），是由可移位因子（transposable
element）介導的遺傳物質重排現象。已經發現"轉座"這一命名并不十分準確，因為在轉座過程中，可移位因子的一個拷貝常常留在原來位置上，在新位點上出現的僅僅是拷貝。因此，轉座有別于同源重組，它依賴于DNA的復制。
1． 轉座子的分類和結構特征
a. 簡單轉座子
轉座子（transposon，Tn）是存在于染色體DNA上可自主復制和移位的基本單位。
最簡單的轉座子不含有任何宿主基因而常被稱為插入序列（insertion
sequence，IS），它們是細菌染色體或質粒DNA的正常組成部分。一個細菌細胞常帶有少于10個IS序列。轉座子常常被定位到特定的基因中，造成該基因突變。IS序列都是可以獨立存在的單元，帶有介導自身移動的蛋白。
b.復合式轉座子（composite
transposon）是一類帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）的轉座子，其兩翼往往是兩個相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某個功能基因兩端時就可能產生復合轉座子。一旦形成復合轉座子，IS序列就不能再單獨移動，因為它們的功能被修飾了，只能作為復合體移動。
2、轉座作用的機制
轉座時發生的插入作用有一個普遍的特征，那就是受體分子中有一段很短的（3-12bp）、被稱為靶序列的DNA會被復制，使插入的轉座子位于兩個重復的靶序列之間。不同轉座子的靶序列長度不同，但對于一個特定的轉座子來說，它所復制的靶序列長度都是一樣的，如IS1兩翼總有9個堿基對的靶序列，而Tn3兩端總有5bp的靶序列。
轉座可被分為復制性和非復制性兩大類。在復制性轉座中，所移動和轉位的是原轉座子的拷貝。轉座酶（transposase）和解離酶（resolvase）分別作用于原始轉座子和復制轉座子。TnA類轉座主要是這種形式。在非復制性轉座中，原始轉座子作為一個可移動的實體直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以這種方式進行轉座。
3.轉座作用的遺傳學效應
① 轉座引起插入突變;② 轉座產生新的基因;③ 轉座產生的染色體畸變;④ 轉座引起的生物進化.
六、RNA代謝
除了某些RNA病毒之外，所有RNA分子都來自于DNA。基因組DNA通過一個被稱為轉錄的過程把貯存在雙鏈DNA分子中的遺傳信息轉換到與模板DNA鏈相互補的RNA單鏈上。
mRNA，編碼了一個或多個蛋白質序列；tRNA，把mRNA上的遺傳信息變為多肽中的氨基酸信息；rRNA，是合成蛋白質的工廠核糖體中的主要成份。
1． 依賴于DNA的RNA合成
從DNA合成反應的化學本質、極性和模板的使用這三方面來說，轉錄與復制是相同的。但是，也存在三個主要不同點：
A． 轉錄中不需要RNA引物；
B．轉錄反應一般只用一小段DNA做模板；
C．在轉錄區，一般都只有一條DNA鏈可以作為模板。
2.RNA合成的終止
一旦RNA聚合酶啟動了基因轉錄，它就會沿著模板5'→3'方向不停地移動，合成RNA鏈，直到遇到終止信號時才釋放新生的RNA鏈，并與模板DNA脫離。
研究RNA鏈終止時遇到最常見的問題是3'端核苷酸的定位，因為活細胞內部根據終止信號正確終止的RNA與一個經過剪接的RNA在3'端沒有兩樣，都是-OH基團。模板DNA上都有終止轉錄的特殊信號--終止子，每個基因或操縱子都有一個啟動子，一個終止子。在新生RNA中出現發卡式結構會導致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5'端的正常結構。寡聚U的存在使雜合鏈的3'端部分出現不穩定的rU·dA區域。
a. 依賴于ρ因子的終止
ρ因子是一個相對分子質量為2.0×105的六聚體蛋白，它能水解各種核苷三磷酸，實際上是一種NTP酶。由于催化了NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA鏈從三元轉錄復合物中解離出來，從而終止轉錄。
有人認為，在RNA合成起始以后，ρ因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產生的能量，沿著5'→3'方向朝RNA聚合酶移動，到達RNA的3'-OH端后取代了暫停在終止位點上的RNA聚合酶，并從模板和酶上釋放RNA，完成轉錄過程。終止過程需要消耗能量，所以，ρ因子具有終止轉錄和核苷三磷酸酶兩種功能。
b、不依賴于ρ 因子的終止
若終止點上游存在一個富含GC堿基的二重對稱區，由這段DNA轉錄產生的RNA容易形成發卡式結構；在終止點前面有一段由4-8個A組成的序列，導致轉錄產物的3‘端為寡聚U。這兩種結構特征的存在同樣決定了轉錄的終止。
在新生RNA中出現發卡式結構會導致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5'端的正常結構。寡聚U的存在使雜合鏈的3'端部分出現不穩定的rU·dA區域。
3.RNA聚合酶II及轉錄因子在啟動子上的裝配
TFⅡH還參與DNA的損傷修復。當RNA polⅡ轉錄過程中碰到受損傷的核苷酸時，TFⅡH能及時啟動核苷酸切除修復系統，將損傷修復。
Actinomycin D和Acridine阻斷RNA鏈的延伸
4.RNA的加工成熟
所以，RNA加工成熟主要包括：5’加帽子結構；3’加多聚A；切除內含子 。
在Group I內含子切除體系中，鳥苷或鳥苷酸的3'-OH 作為親核基團向Intron 5'的磷酸二酯鍵發起進攻。
Group II內含子切除體系
核內mRNA原始轉錄產物的剪輯方式可能是最常見的。在這一模式中，RNA的剪輯需要特異性RNA-protein-復合物small
nuclear rebonucleoproteins（snRNP）和small nuclear
RNAs（snRNAs）。已經發現至少有5種snRNAs--U1，U2，U4，U5，U6。
第五講 分子生物學研究法
一、 重組DNA技術發展史上的重大事件
1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，解決了遺傳的物質基礎問題；
2.50年代提示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半 保留復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題；
3.50年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。
年份 事 件
1869 F Miescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。
1944 O.T. Avery證實DNA是遺傳物質。
1952 A.D. Hershey和M.Chase再次證實和噬菌體的遺傳物質是DNA。
1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結構的雙螺旋模型。M.Wilkins用X-射線衍射法證實了這一結構。
1957 A.Kornberg從大腸桿菌中發現了DNA聚合酶I。
1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留復制模型。
1959-1960 S. Ochoa發現RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質分子中的氨基酸序列。
1961 Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F. Jacob和J. Monod提出了調節基因表達的操縱子模型。
1964 C. Yanofsky和S. Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關系。
1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列測定；科學家證明細菌的抗藥性通常由"質粒"DNA所決定。
1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯了全部遺傳密碼。
1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒中發現反轉錄酶。
1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人發展了DNA重組技術，于72年獲得第一個重組DNA分子，73年完成第一例細菌基因克隆。
1975-1977 F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發明了DNA序列測定技術。1977年完成了全長5387bp的噬菌體φ174基因組測定。
1978 首次在大腸桿菌中生產由人工合成基因表達的人腦激素和人胰島素。
1980 美國聯邦最高法院裁定微生物基因工程可以ZL化。
1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster獲得轉基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到轉基因果蠅。
1982 美、英批準使用第一例基因工程藥物--胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。
1983 獲得第一例轉基因植物。
1984 斯坦福大學獲得關于重組DNA的ZL。
1986 GMO首次在環境中釋放。
1988 J. D. Watson出任"人類基因組計劃"首席科學家。
1989 DuPont公司獲得轉腫瘤基因小氧--"Oncomouse"。
1992 歐共體35個實驗室聯合完成酵母第三染色體全序列測定(315kb)
1994 第一批基因工程西紅柿在美國上市。
1996 完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測定。
1997 英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。
基因工程中常見的名詞:
遺傳工程--genetic engineering，基因操作--gone manipulation，基因克隆--gone cloning，
重組DNA技術--recombinant DNA technology，分子克隆--molecular cloning。
基因工程的主要內容或步驟:
1. 從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。
2. 將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。
3. 將重組DNA分子轉移到適當的受體細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。
4. 從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經得到擴增的目的基因。
5. 將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現功能表達，產生出人類所需要的物質。
二、 基因操作的主要技術原理
1． 核酸的凝膠電泳(Agarose & Polyacrylamide)
將某種分子放到特定的電場中，它就會以一定的速度向適當的電極移動。某物質在電場作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場強度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數成正比，而與分子的磨擦系數成反比（分子大小、極性、介質的粘度系數等）。
在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團是離子化的，所以，DNA和RNA實際上呈多聚陰離子狀態（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場中，它就會由負極→正極移動。
在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）--ethidium bromide染色，此時，核酸分子在紫外光下發出熒光，肉眼能看到約50ng DNA所形成的條帶。
DNA的脈沖電泳技術 :PFGE-Pulse-field gel electrophoresis
2． 核酸的分子雜交技術
在大多數核酸雜交反應中，經過凝膠電泳
分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細管作用或電導作用按其在凝膠中的位置原封不動地"吸印"
轉移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）等。
核酸分子雜交實驗包括如下兩個步驟：
將核酸樣品轉移到固體支持物濾膜上，這個過程特稱為核酸印跡(nucleic
acid blotting)轉移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法(dot and slot
blotting)、菌落和噬菌斑印跡法(colony and plaque blotting)；
將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標記或其它標記的DNA或RNA探針進行雜交。所以有時也稱這類核酸雜交為印跡雜交。
3． 細菌的轉化
所謂細菌轉化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA，而導致性狀特征發生遺傳改變的生命過程。這種提供轉化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。大腸桿菌是最廣泛使用的實驗菌株。在加入轉化DNA之前，必須預先用CaCl2處理大腸桿菌細胞，使之呈感受態（Competent
Cells）。Mg2+對維持外源DNA的穩定性起重要作用，質粒DNA中的抗生素是篩選標記。
對絕大多數hsdR-，hsdM-突變體菌株（k12），每ug DNA可得107-108個轉化子。