制備高效液相色譜通常都被認為和大色譜柱和高流速有關。然而并不是以設備的大小和系統消耗的流動相的多少來決定制備高效液相色譜的實驗,而是依據實驗的分離目的來決定。分析液相的目的是給一種組份進行定量和定性。制備液相的目的是對產品的單體進行提取和純化。與傳統的純化方法(如蒸餾、萃取)比較,制備液相是一種更有效的分離方法,因此被廣泛應用在樣品和產品的提取和純化上。隨著合成、植化、生化和制藥等領域對高純度組份的需求不斷增加,制備液相應用的領域也在迅速的擴大。
制備方法的發展和擴大規模的計算:
在分析液相中色譜柱的典型進樣量是微克級,甚至更低。樣品量和固定相之比有的甚至小于1:100000。進樣體積一般來說都大大小于色譜柱體積(小于1:100)。 在這種條件下,會達到很好的分離效果,峰形尖銳并且很對稱。而在制備液相中,最大的區別就是超量進樣。
吸附變化線:分析液相的目的是給一種組份定性、定量。重要的色譜參數有溶解度、峰寬和峰的對稱性。如果進樣量越來越多,峰高和峰面積會增加,但峰的對稱性和容量因子保持不變。如下圖。
在分析液相中,最佳的峰形應是一條高斯曲線。峰的標準背離 бV 描述了其對稱性和與高斯曲線的相似性。容量因子是與一種不保留物質的保留時間t0相關的保留時間。如果將超過一定量的樣品注射進色譜柱,吸附變化線就會成非線性。這意味著峰形會變的不再對稱,表現為嚴重的拖尾和容量因子的縮小。如下圖。在制備液相中,這種效果稱作濃縮超量進樣。在一些情況中,根據進樣量的增加,容量因子也相應變大,并造成很強的前峰。既然吸附變化線取決于組份的多少,那么液相色譜柱的載樣能力就必須根據不同的制備液相實驗來決定。
色譜柱載樣和超量載樣:
大樣品量的純化有兩種可行的方法:分析系統的放大或色譜柱超量載樣。分析系統的放大意味著使用直徑更大的制備柱、更高的流速和根據色譜柱的長度增加進樣量并保持樣品濃度不變。峰形仍會保持尖銳而對稱。這種方法需要大型的色譜柱和大量的溶劑來分離較少的樣品,因此這種方法是不經濟的。因此色譜柱超量載樣,暨在相同的分析條件下超量進樣通常是一種很好的選擇。使用色譜柱超量載樣的方法,在分析柱上甚至可以進行毫克級的分離。但更大量的樣品分離就需要整個系統的放大。色譜柱超量載樣可以通過兩鐘方法進行—濃縮法和體積超載法。在濃縮法中,樣品的濃度會提高,但進樣體積保持不變。容量因子k’降低,同時峰形從高斯曲線變為三角形。如下圖。濃縮法超量載樣只有在樣品組份在流動相中具有良好的溶解性的條件下才有可能采用。
如果樣品組份的溶解性很差,濃縮法超量載樣不能使用。同時更多的樣品體積注射到色譜柱中,這種技術稱作體積法超量載樣。超過一定的進樣體積,峰高不變,但峰變寬并且呈矩形。在制備液相中濃縮法超量載樣比體積法超量載樣更受歡迎,因為可被分離的樣品量更高。既然組份的溶解性通常是一個限制因素,所以兩種超量載樣技術通常被結合起來使用。下表是兩種技術的概覽。
濃縮法超量載樣 體積法超量載樣
取決于組份在流動相中的溶解性 取決于進樣體積
吸附變化線的制備部分 吸附變化線的分析部分
生產效率決定于選擇性 生產效率決定于制備柱直徑
受固定相粒度大小的影響不大 需要小顆粒填料
方法的放大:
濃縮法超量載樣和體積法超量載樣都會導致組份溶解性的降低。既然組份的分離需要一定的溶解性,那么在放大分析方法的時候,優化溶解性、特別是選擇性就是一項很重要的工作。如下圖。因為選擇性和超量載樣潛力是相互依靠的,選擇性的提高會提高一次運行中所分離的樣品量,因此從分析方法到制備方法的放大和方法的優化需要三個步驟。1. 優化分析方法的選擇性。2. 在分析柱上進行超量載樣。3. 放大到制備柱。優化分析方法對于制備方法中餾份的再分析也是很有價值的。
放大的計算:
從分析液相到制備液相的放大計算可以根據下圖中的公式計算。在進行放大計算并進行第一次實驗后,通常要優化參數來得到更好的分離結果。
分析柱 V1 = r12 制備柱
V2 r22
流速:0.6毫升/分鐘 流速:至30毫升/分鐘
進樣體積:15微升/次 進樣體積:750微升/次
X1 = X2 x 1
πx r12 πx r22 CL
X1 = 最大柱體積 1 = 15微升
r1 = 柱半徑 1 = 1.5毫米
X2 = 最大柱體積2 = ?
r2 = 柱半徑2 = 10.6毫米
CL = 兩柱長度的比例 = 1
制備型高效液相色譜的目的:判斷制備型高效液相色譜使用的結果有三個重要參數:產品的純度、產量和生產效率。三個參數之間是相對獨立的,因此很難同時使用這三個參數來優化制備型高效液相色譜方法。