分離人腸黏膜單個核細胞

基 本 方案 離 人 腸 黏 膜 單 個 核 細 胞

材 料

新鮮的大腸或小腸樣本，外科手術后分離獲得

H B S S ，不含鈣和鎂， p H 7. 2

D T T - H B S S 溶液： 75m g D T T 溶于 50 ml H B S S ，新鮮配制

E D T A - H B S S 溶液

消化酶溶液，新鮮配制

R P M I -IO 完全培養基

VFicoll 分離液，密 度 為 L 076?1.078 g/ml

30 % Percoll 溶液

一 次 性 250m l 有旋蓋平底塑料容器、彎頭鑷和彎頭眼科剪

I O O m m 和 50m m 塑料培養皿

5c m 磁性攪拌子，有菌或無菌

磁性攪拌器，室 溫 和 37°C

光學顯微鏡

250 ml —次性帶旋蓋的埃倫邁爾燒瓶，無菌

外科無菌手套

I O c m 無菌玻璃漏斗

50m l 無菌錐形底離心管

聚 苯 乙 烯 環（5c m 直徑， I c m 高度）

Nitex濾 網（1 0 0 目； Tetko) ，剪 成 I O c m 方形大小

1 . 用冷的自來水徹底沖洗外科分離的大腸或小腸樣品，以除去血和管腔內容物，沿管腔垂直剪開，肉眼觀察黏膜。根據臨床診斷、解剖定位、大小及形態學特征，切取合適的區域[來自乙狀結腸切除術或者回腸切除術的樣本，平 均 大 小 為（2?3) c m X(2?10)c m ，重 量 約 10 g]。如果獲得的組織塊過大，則將其切為大小均一的樣本，分別處理。

2 . 將切除的組織浸于100 ml H B S S 溶液中，放置在一次性250m l 平底塑料容器內，迅速轉移至實驗室。

3 . 用 IOOml新 鮮 的 H B S S 溶液沖洗樣本，去除壞死組織和糞便。輕輕吸干黏膜表面水分 ，去除過多的黏液。再 用 H B S S 清洗樣本一遍。

4 . 將組織平鋪于紙上，黏膜面朝上。從樣本的邊緣用彎頭鑷輕輕地夾起黏膜。從提起的樣本邊緣開始用彎頭剪剪開黏膜和肌肉層。如果可能，在環狀褶的位置垂直切去肌肉，得 到 5m m 長和寬的樣本。肉眼檢查樣本以了解肌肉是否被完全清除。把黏膜片放到含有100m m H B S S 的培養皿中。

5 . 在含有新鮮H B S S 的培養皿中徹底清洗黏膜片，清 洗 后 將 其 移 入 含 有 50 ml D T T /H B S S 的 250m l 平底塑料容器內，旋上蓋子。將容器置于攪拌器上， 60r/m i n 室溫攪拌 30m i n 以松解殘余的黏膜和碎片（溶液會逐漸變為輕度混濁，并含有一些小的漂浮碎片）。

6 . 取出黏膜碎片和攪拌子，放入含 有 新 鮮 H B S S 的培養皿中清洗，并轉移至另一含有100m l E D T A /H B S S 的容器中。室 溫 攪 拌 90 min，讓溶液中的組織劇烈振動，使上皮細胞從基底膜脫落。

7 . 根據情況，重復攪拌一次或兩次，直到上皮細胞基本脫落。若在攪拌過程中溶液變得非常混濁，應及時更換。

8 . 將黏膜片和攪拌子移至一含有100 ml H B S S 的新的容器中。 30m i n 更 換 一 次 H B S S逐步清洗黏膜片直到洗液變得澄清（一 般 洗 2?6 次）。有些重度炎癥組織樣本可能出現一些不確定的情況，需要區分預期的脫落上皮細胞、繼續脫落的細胞及碎片，以避免攪拌過度導致上皮細胞的丟失。若出現可疑物質，用顯微鏡仔細檢查漂浮的物質。

9 . 在 無菌的含有5m l 消化酶溶液的50m m 的培養皿中用眼科剪剪碎黏膜片至 5m m 大小 。將平皿內的物質全部倒入無菌的含有IOOml消化酶溶液和磁性攪拌子的250 ml埃倫邁爾燒瓶中。若黏膜片很大，用兩個或更多的埃倫邁爾燒瓶。旋松瓶蓋，置于磁性攪拌器上， 37°C ， 60r/m i n 攪拌> 8 h 。

1 0 . 戴上外科手套，將 IO cm 直徑的玻璃漏斗架于 50m l 錐形離心管上。在聚苯乙烯環下放 置 IOcm2 的 N ite x 濾網，使其牢固。若 步 驟 9 中用兩個燒瓶，則需要兩套獨立的過濾設備。

1 1 . 視上清的顏色和氣味檢查埃倫邁爾燒瓶中是否有細菌污染，若顯微鏡證實有污染則應重新制備樣品。

1 2. 將埃倫邁爾燒瓶 450 角 傾 斜 30s 使組織碎片沉淀。將上清緩慢倒入濾器上。避免將組織倒入濾器以免堵塞。必要時可以更換離心管。若液體稠厚或含有過多碎片可以重 復 過 濾（反復炎癥腸黏膜取出大塊樣本時可見）。

1 3 . 室溫， 400 g 迅速離心，棄上清。用 RPMI-10 完 全 培 養 基 重 懸 所 有 沉 淀 物（包括步驟 1 和 步 驟 9 獲得的樣品）。沉淀物往往較大而且由于紅細胞污染會帶有淡紅色。

14.計 數 細 胞（附 錄 3A )，并用臺盼藍拒染法了解細胞的活力（附 錄 3C )。注意細胞的密度、死細胞的比例、可能污染的上皮細胞及細胞團塊的存在與否。若活細胞比例< 5 0 % 或存 在 許 多 團 塊（炎癥樣本可能出現），用 尼 龍 柱 過 濾（見輔助方案）。

1 5 . 將細胞懸液分成幾個等份分別置于50m l離 心 管 中（每 份 都 需 用 Ficoll密度液進行分離，樣品若有6 0 % ?7 0 % 的細胞活性需要用4?8 份梯度液進行分離），每一份都用 25m l的 HBSS稀釋。

16 . 緩慢加入12m l 的 Flcoll密 度 液（避免破壞液面），蓋緊蓋子，室溫， 2100 g 離心 5 min。

1 7 . 丟棄最上層的物質。液面交界處有一層細胞，白色松散狀，比 P B M C 分離后更寬且分界不明顯，用 5m l 移液管小心吸取交界層細胞加入新的50m l 離心管，每兩個梯度用一管。避免吸人下層的Ficoll密度液和管壁上細胞團塊。

1 8 . 在離心管中加滿H B S S ，蓋 緊 蓋 子 ，翻轉混勻，室溫 ， 400 g 離 心 5 min，棄上清。將所有沉淀物移入一個離心管內，重復離心。用 5?IOml R P M I -I O 完全培養基重懸沉淀物。計數細胞，并用臺盼藍拒染法了解細胞的活力。

19.可選：若最終的細胞懸液中含有> 2 0 % 的死細胞，表 示 Ficoll 分離液用量不足，或者分離前需用尼龍柱預過濾。為了獲得更多的活細胞，可以將細胞分成幾等份并加于 2?4 倍 體 積 的 Percoll 上（單 元 2. 5)，離心。對每份而言，在 50m l 離心管內，
將 51111 細胞懸液加于 201111 3 0 % 的 ？ 61*〇〇 11 上，室溫， 400^’離心 20111 丨 11。取底部沉淀
的活細胞。
2 0 . 立即使用細胞，或 用 R PMI-IO完全培養基重懸細胞， 4°C 暫時存放細胞（不能過夜）。

輔 助 方 案 用 尼 龍 毛 過 濾 器 去 除 死 細 胞

附 加 材 料（其他材料見基本方案，帶 V 項 目 見 附 錄 1)

3 通管

20m l 尼龍毛柱

1 . 過 濾 前（見基本方案，步 驟 1 4 ) 將細胞轉移至50m l 離 心 管 中（< 2 X 10⁸ 個細胞/柱）。加 滿 H B S S 重復顛倒混勻。去除大的細胞團塊以防止過多細胞黏著從而堵塞尼龍柱。

2 . 將 20m l 尼龍毛柱連于 3 通管并固定于直立的環架上。柱下接一 新 的 50m l 離心管收集細胞。

3 . 打 開 3 通管讓細胞懸液有序進入尼龍柱，用 H B S S 洗柱子，若收集細胞的離心管已滿可以更換，直到收集總體積達 100m l 。應保持尼龍毛基質完全濕潤。若流速很慢，用無菌 Pasteur 吸管攪拌柱的頂部（避免重懸整個柱內基質）。

4 . 室溫， 400 貧離心5 min。棄上清，用 H B S S 重懸沉淀物。調節體積以進行 Ficoll分離(見基本方案，步 驟 15)。