3.材料和方法
塑料CrystalCard由烯烴共聚物制成。每一個CrystalCard有兩個分開的微細管大約有10μL體積。每一個微細管都可以完成一個優化實驗。CrystalCard中液滴的形成要求低表面能的表面。這樣可以確保傳遞液(FC-40)優先浸濕微細管壁。為準備液滴形成的微細管表面，Cytonix PFC 502AFA溶液用于涂抹微細管內部。使用涂層，CrystalCard通過Cytonix 502AFA入口充滿，而且能在室溫下儲存0.5到1小時。通過真空從CrystalCard去除502AFA溶液，緊接著在333–343 K固化1小時。
CrystalCard有四個液體進去口，依次為傳遞液（1），蛋白質（2），沉淀劑（3）和緩沖液（4）。緩沖液，蛋白和沉淀劑進入通道合并為3 + 1 mixer，這里水溶液相結合，并分割成單個液滴的惰性和不混溶流體載體。注射器和聚四氟乙烯管被傳遞液回填，需要的水溶液都從聚四氟乙烯套管末端吸入。通過聚四氟乙烯管和一個聚丙烯連接器完成CrystalCard連接，形成一個密封的CrystalCard口。實驗的組成液體安置在帶有注射器泵的聚四氟乙烯管，通過以前使用的MicroPlugger泵控制軟件在一定程度上傳遞到CrystalCard(Gerdts et al., 2008)。CrystalCard上的液體配置顯示在圖2。
水溶液的流動速率可以改變，這樣可以有一系列梯度的液滴的生成。本研究中，我們首次使用兩種類型的梯度（表1和圖3）。1型梯度中，蛋白質以恒定的速率(2μL min-1)傳送盡管沉淀劑和緩沖液形成線性梯度（總的沉淀劑和緩沖液流量保持恒定2μL min-1）。對于大多數1型梯度，沉淀劑的流量開始時設定為2μL min-1，隨后流量慢慢的減小，緩沖液以相同的數率緩慢的增加。因此在所有的1型實驗中，蛋白濃度保持恒定只改變沉淀劑的濃度（表1）。在梯度2型中，在蛋白和沉淀劑之間產生動態梯度。在梯度2型中，蛋白流量緩慢減少，沉淀劑流量緩慢增加，緩沖液流量保持恒定（表1）。總的來說，1型梯度首先產生蛋白/沉淀劑組合，如果沒有結晶體篩選，2型梯度通常緊接著產生。
表1：本研究中使用的1型和2型MPCS梯度流量表（μL min-1)
圖3：通過MPCS優化產生的結晶體獲得的高質量的數據集(2.5 A °或更好)和/或新的蛋白結構。液滴下市對應的蛋白結構圖（數據采集和統計數據見表2）。所有的比例尺=200μm。（a）從Mycobacterium tuberculosis得到的Enoyl-CoA水合酶（1.8 A ° ; PDB code 3h81);（b）Bartonella henselae中的得到的醛脫氫酶（2.1 A ° ; PDB code 3i44;通過坐滴法優化產生的2.0 A °的編碼3i44的結構已存入PDB數據庫，2.1 A °分辨率的數據集是由MPCS結晶優化產生的）；（c）從Burkholderia pseudomallei得到的蛋氨酸-R-亞砜還原酶（1.7 A ° ; PDB code 3cxk）；（d）Brucella melitensis中得到的甲基異檸檬酸裂解酶（2.9 A ° ; PDB code 3eoo);（e）Babesia bovis中得到的二氫葉酸還原酶/胸苷酸合成酶(2.5 A ° ; PDB code 3i3r);（f）Bartonella henselae中得到的tRNA 鳥嘌呤-n1-轉甲基酶（2.5 A ° ; PDB code 3ief);（g）商品化的MPCS Plug Maker圖片。左：用戶界面和CrystalCard成像的觸摸屏。右：儀器樣品臺用于載入CrystalCard和結晶樣品。
本研究中使用的沉淀劑可以從Emerald Biosystems(Wizard I, Wizard II, Wizard III, JCSG+ and Precipitant Synergy)或Hampton Research(Crystal Screen HT and Index HT)得到。用戶指定的Wizard I和Wizard II也可以使用。Wizard I和Wizard II主要沉淀劑濃度增加50-100%。
CrystalCard中直接提取的結晶體可以直接用于下游的X射線衍射分析（圖2d）。100μm厚的粘合層剝離后為了暴露理想的結晶體用于收獲。通常吸取大約1微升的事先準備的冷凍保護劑在理想的結晶體上。之后結晶體使用傳統的尼龍冷環玻璃化法從微細管中拿出，（約2毫米直徑，Hampton Research)，儲存于液氮中用于X射線分析。在個別情況下，結晶體被發現在100μm的連接層。在這種情況下，結晶體被冷凍保護劑覆蓋并且從塑料層頂部收獲。
4.結果
MPCS梯度在優化氣象擴散結晶采樣數時有很高的成功率。通過MPCS優化的29種蛋白中，有28種（93%）使用MPCS優化后結晶。本研究中使用的許多蛋白在最初的篩選中使用多于一種沉淀劑溶液。總之，120種不同的蛋白/沉淀劑結晶組合在氣象擴散法中產生。在這120種組合中，MPCS優化實驗中產生的90（75%）的結晶—結晶的成功率很高，許多最初的結晶體不是單晶，但是微晶或沉淀物看起來像是結晶體（圖1）。此外，MPCS實驗體積明顯減小（50-100倍）同時從氣象擴散法得到的結晶體轉變為batch-under-oil-style結晶。再次，在氣象擴散法中不能產生結晶的10種沉淀劑溶液被用于MPCS優化實驗中能夠產生結晶體。這些特殊的沉淀劑用MPCS進行了測試（盡管用氣象擴散法不能產生結晶體），因為他們和其他的能夠在氣象擴散實驗中產生結晶體的沉淀劑溶液具有相似的化學成分。總的來說，使用這種方法測試了17種沉淀劑溶液，有十種可以產生結晶體（59%）。這表明，利用MPCS在標準結晶體篩選中優化每一種沉淀劑可能會產生許多特殊的結晶體采集數，這些采集數可能會在單一的氣象擴散試驗中失敗—與batch-under-oil-style結晶的氣象擴散相比于先前報道的數據一致(Baldock et al., 1996;D’Arcy et al., 2003)。超過90%的沉淀劑溶液用氣象擴散試驗檢測的用MPCS不用檢測，這表明，利用MPCS有潛在的發現新的結晶體采集數的能力。本研究中使用了各種各樣的沉淀劑溶液，包括各種鹽溶液，低pH（4.5）到高pH（10.5）溶液，高粘度聚乙二醇溶液和有機物如異丙醇和2-甲基-2,4-戊二醇。