實驗概要
磺胺類藥物是抗菌藥，被廣泛應用于動物和人，但常常造成藥物殘留，各種檢測藥物殘留的方法已經被應用。本試驗利用酶聯免疫吸附方法，檢測磺胺類藥物的濃度，為實際應用提供參考。
主要試劑
150ml甲醇，50ml三甲基硅烷，500ml乙酸乙酯，500ml飽和碳酸鈉，80ml飽和氯化鈉，100ml 4M鹽酸 ，100ml 2M NaOH，100ml吡啶，20ml乙醇， 50g硫酸鎂，7.8 g(2-氨基-4-噻唑)-乙酸，(2-氨基-4-噻唑)-乙酸甲酯
實驗步驟
1.單克隆抗體的制備
免疫老鼠：四只雌性的(Balb/c Ola Hsd)老鼠，10-12周齡，皮下免疫，50μgBSA-或KLH-半抗原結合物在100μlPBS中，和100μl的弗氏佐劑乳化；間隔2周再次免疫，免疫前從每一只老鼠中采血，每次注射后一周采血。血液通過間接ELISA測定，抗體抗OVA-TS。
1) 融合與克隆
在融合前4-5天預處理四只老鼠，腹腔內注射25μg免疫原用200μlPBS ，選擇一只老鼠產生雜交瘤，其他老鼠的脾臟細胞儲存在液氮中。
2) 雜交瘤細胞分泌單克隆抗體
準備磺胺噻唑衍生物，用鼠的骨髓瘤細胞P3/NS-1/1-Ag4–1 (NS-1)，非分泌型老鼠骨髓鼠(American Type Culture Collection，Rockville，MA，USA)。瘤細胞和脾(脾來自老鼠98008)融合，比例為1:2，使用PEG1500沉淀物。細胞被懸浮在HAT選擇型培養基中(培養基DMEM 8% FCI hybridocult 0.5%P/S) 1% HT 1% A在96孔板細胞培養板中培養(細胞數大約1×105)，一周以后，培養基改換成HT培養基(培養基 1% HT)，5天以后，改換培養基。從12天到14天，雜交瘤的上清液被檢測，針對磺胺噻唑的檢測使用間接ELISA；培養基包含細胞分泌的抗體結合物，進一步檢測磺胺的自由基用iELISA。陽性培養孔被立即克隆，通過有限稀釋法((average 0.5 cells/well；Goding，1986)直到穩定(2-3克隆)，生產的單克隆抗體從96孔板轉移到0.5ml 24孔培養基中，再被轉移到5-20ml培養瓶中培養。單克隆抗體的免疫球蛋白亞類通過Isotyping Kit of Boehringer Mannheim檢測(德國)。
間接ELISA
2. 抗體滴度的測定
1)將TS-OVA加入緩沖液中(50 ng/100μ l/well)，包被ELISA板，作為固相階段的免疫媒介。4oC培育過夜。將1%的ova加于包被緩沖液中(50mmmol-1碳酸鈉。Ph9.6)室溫至少一小時。使用之前，板子用緩沖液洗四次，每孔加入一系列稀釋血清或者培養基上清液100μL。
2)板子在室溫培育至少一小時，用洗液洗滌四次。隨后，每孔加100μ l兔抗鼠的IgG-HRP(1:2500用pbs稀釋)，室溫溫育1h，洗板，測定過氧化物，每孔加100μ l的四甲基聯苯胺過氧(化)物酶酶作用物系統(新鮮配制，TMB過氧(化)物酶酶和酶作用物，1/1；v/v)。室溫條件下避光培育20-30分在，添加另外100μ l，1M磷酸鹽溶液終止反應，使用Argus 400 microplate reader (Canberra Packard，Downers Grove，IL，USA)在450nm測定光吸度值。血清滴度作為最終的滴度，導致了吸收率在2.0
3. 競爭iELISA鑒定抗體特性
洗板(看抗體滴度的測定)，向板中加入不同濃度50μ l磺胺標準液，不同濃度50μ l稀釋的血清或培養基上清液。進一步處理如前一步步驟。在總的18種磺胺藥中，用競爭的方法檢測(看圖一)。在檢測培養基上清液時，按單個磺胺藥0.01，0.1，1and10 μg/ml相應的 0.5，5，50and 500 ng well–1加入板中。血清競爭中，標準溶液濃度為1000gml–1(5000 ng well–1)。
1) 間接優化實驗
a.單個磺胺藥的標準曲線(0.1–100 ng/ml)使用于做單克隆抗體的間接ELISA最優化的實驗中。三種包被原濃度在微型滴度板上(5，25，50ng蛋白質板)被競爭，單克隆抗體的濃度是不同的。第一次溫育的時間不同(0.5， 1，2 and 4 h 和過夜)和溫度不同(4-6°C，室溫37°C)。HRP標記的第二抗體濃度不同，第二次溫育形式與第一次溫育是不同的。
b.磺胺藥的合成路線如圖2，準備TS按Sheth & Sporns (1991)修改過的方法。使用三甲基氯硅烷介導的酯化過程準備2-氨基-4-噻唑-乙酸乙酯。合成的酯有一個融化溫度為122–125°C，Sheth & Sporns報道的熔點溫度為169–171°C。
c.對于合成N4-acetyl-N1-[4-[(methoxycarbonyl)methyl]-2-thiazolyl]-sulfanila-ts，Sheth & Sporns (1991)回流反應1.5h，在熱水中萃取。因此，本試驗室溫攪拌條件完成此合成反應，在PH3時產品形成沉淀，過濾。
d.通過Erlanger et al.(1957) 測定自由苯氨基經修改的Bratton Marshall (BM)Garden & Sporns (1994)法測定TS-蛋白比例。對于BSA結合物比例的測定，通過Erlangeret al. 15mol of hapten mol–1of protein和33molmol–1 with the BM reaction。對于，按276 molmol-1(Erlanger)和203 molmol–1(BM)測定KLH結合物的比率。(KLH分子質量為3000kDa)
4. 血清抗體滴度和特異性的測定
血清抗體來源于四只老鼠(98005-98008)，用KLH和BSA半抗原識別半抗原OVA免疫，當免疫前血清和OVA半抗原反應或當血清從免疫的老鼠中被檢測抗OVA，此時不會反應。對于老鼠免疫用KLH-TS，(998005和98006)滴度范圍1/3000(老鼠5)和1/9000(老鼠6)第一次注射檢測后到第四次檢測為1/200000(98005)和1/400000(98006)。對于老鼠免疫用BSA-TS(98007和98008)這個滴度范圍是在第一次注射后為1/3500(98007)和1/5000(98008)，在第三次注射后為1/50000(98008)，在第四次注射后為1/150000(98007)，用競爭ELISA檢測四只老鼠的血清(對應18種磺胺藥)產生這個最優化的最終濃度。磺胺噻唑和磺胺甲二唑在最低的濃度(0.2-4gml–1at 50%)競爭抑制磺胺氯達嗪(0.8–5 gml–1)和磺胺甲氧嗪(3–7 gml–1)。老鼠免疫用KLH-TS，這個老鼠(98006)血清表現競爭最低濃度。老鼠免疫用BSA-TS，老鼠98008血清表現競爭最低濃度，98008老鼠的脾細胞被用作融合實驗。
5. 單克隆抗體的生產
在兩次加強注射后，98008老鼠被預處理用最后將加強注射，四天后分離脾細胞，一個月后，再額外加強注射，相同的過程被實施在其它三只老鼠身上，脾細胞被儲存在液氮中。新鮮的老鼠脾臟細胞用于融合用雜交瘤細胞。iELISA篩選550孔結果，21孔用細胞培養基上清液和包被OVA-TS的板子反應。這些上清液用iELISA篩選最優化稀釋和篩選與磺胺噻唑的競爭。在這些上清液中的五個克隆團(3A1；4E10；14G11；
26E5和27G3)發現競爭。
Haasnoot W.；Du Pre J.；Cazemier
G.；Kemmers-Voncken A.；Verheijen R. Monoclonal antibodies against a
sulfathiazole derivative for theimmunochemical detection of
sulfonamides. Food and agricultural immunology. 2000, 12(2)