| 實驗步驟 |
材料
緩沖液與溶液
貯存液、緩沖液與試劑的成分見附錄 1。
稀釋貯存液至所需濃度。
DMSO(30%)/含血清培養基
第 3 步使用 DMSO 前，將高效液相（HPLC) 純或組織培養純的 DMSO 加入含血清的細胞生長培養基中至終濃度 30%(V/V)。
Giemsa 染液（10%m/V)
使用前用磷酸緩沖鹽或水配制，用 Whatman1 號濾紙過濾。
甲醇
Polybrene(10 mg/ml)
用水溶解 Polybrene(Aldrich) 至終濃度 10 mg/ml，用 0.22 mm 的濾器過濾除菌, 分裝成小等份（0.25 ml),-20°C 保存備用，使用后丟棄。
丁酸鈉（500 mmd/L)(備選）
在化學通風櫥內，用 10mol/LNaOH 調節丁酸鈉貯存液至 pH7.0。用 0.22um 的濾器過濾除菌，分裝成 1ml 的等份，-20°C 保存。
核酸與寡核苷酸
要轉染的 DNA，如質粒 DNA, 用水溶解至 1ug/ul。
培養基
最低基礎培養基（MEM)-α(含 10% 胎牛血清的培養基，不含血清的培養基與選擇性培養基）
特殊設備
組織培養皿（90 mm)
此方法適用于用 90 mm 培養皿培養細胞。如果使用其他多孔板、細胞瓶或其他直徑的培養皿，按比例改變細胞濃度與試劑的用量。見表 16-3。
附加試劑
本方案第 6 步可能需要第 17 章方案 7 或方案 1 輔助方案所列試劑。
細胞與組織
指數生長的哺乳動物細胞
方法
1. 通過胰酶消化收集細胞（如 CHO 細胞)，將每 5X105 細胞用 10 ml 含 10% 胎牛血清的 MEM-α培養基平鋪于 90 mm 組織培養皿上。于含 5%~7%CO2 的 37°C 溫箱培養細胞 18~20 h。
2.
用 3 ml 溫熱的含血清、DNA(5ng~40ug，無載體 DNA)、30ug Polybrene 的培養基替換原來的培養基。先將 DNA
與培養基混勾再加入 10 mg/ml Polybrene。細胞繼續孵育 6~16 h。孵育早期階段每 90 min
搖動培養皿一次，使細胞均勻接觸 DNA Polybrene 混合物。
3. 吸去含 DNA-Polybrene 的培養基，加 5 ml 含 30%DMSO、含血清的培養基。輕輕搖動培養基，使細胞均勻接觸溶液，培養皿置于孵箱中。
4. 孵育 4 min 后，從孵箱中取出培養皿，快速吸去 DMSO 培養基。用無血清的溫熱培養基洗滌細胞一至兩次，加入含 10% 胎牛血清的完全培養基。如果需要丁酸鈉促進轉染，則繼續步驟 5, 如果不需要，則在含 5%~7%CO2 的 37°C 溫箱培養細胞 48 h。然后直接進行步驟 6(檢測瞬時轉染）或 7(穩定轉染)。
DMSO 處理的細胞易于脫落，因此在棄去含溶劑的培養基及加入新培養基時應盡可能動作輕柔，比如，每次換液時沿著培養皿側壁吸培養基。
5.(選作）為了促進 DMSO 與 Polybrene 處理過的細胞的轉染：
a. 在培養基中加入 500 mmol/L 丁酸鈉至終濃度 2.5~10 mmol/L。
丁酸鈉的確切濃度要根據細胞類型而定。
b. 在含 5%~7%CO2 的 37°C 溫箱培養細胞 20~24 h。
c. 棄去含丁酸鈉的培養基，換成含 10% 胎牛血清的無丁酸培養基。細胞于孵箱內培養。
丁酸鈉可促進 DMSO 處理過的細胞的瞬時（不能持久）表達某種重組質粒（Aubin et al.1997)，尤其是在猿與人細狍中的帶 SV40 早期啟動子/增強子的質粒（Gorman et al.1983a)。
6. 如果要穩定轉染細胞，直接進行第 7 步。如果要瞬時表達則按照下述方法在轉染 1~2 天后檢測細胞：
? 如果使用的是表達 E.coli.β-半乳糖苷酶的質粒 DNA 按第 17 章方案 7 所列操作步驟檢測細胞裂解液中酶活性。或者按照本章方案 1 的附加方案中介紹的組化染色方法操作。
? 如果使用綠色熒光蛋白表達載體，在 450~490nm 光照下用顯微鏡檢測細胞。
? 如果表達的是其他基因產物，則通過體內代謝標志物進行放射免疫、免疫印漬、免疫沉淀或測定細胞提取物的酶活性來分析新合成蛋白。
為減小不同培養皿之間轉染效率的差異，最好（1）用每一構建體轉染數個培養皿；（2）孵育 24 h 后用胰酶消化細胞；（3）將細胞匯集起來；以及（4）重鋪細胞于數個培養皿上。
7.
分離穩定轉染體：用非選擇性培養基培養細胞 48 h[使轉移的基因表達（第 4 步）]
后，胰酶消化細胞或用適當的選擇性培養基重鋪細胞，也可以直接將選擇性試劑加入培養基中。每 2~4 天換液一次，持續 2~3
周，目的是去除死細胞殘骸，并允許抗性細胞克隆生長。
8. 此后，克隆，繁殖獨立克隆以用于檢測 [方法見 Jakoby and Pastan 1979 或 Spector et al.1998b(《細胞實驗手冊》的第 86 章）]
用預冷的甲醇固定細胞 15 min，然后室溫下用 10%Giemsa 染色 15 min, 流水沖洗, 這樣可以記錄細胞克隆數目。Giemsa 染液應使用前用磷酸鹽緩沖液或水新鮮配制，用 Whatman 1 號濾紙過濾。
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