利用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞

實驗概要

本實驗用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化了外周血單個核細胞。

實驗原理

常用來分離人外周血單個核細胞（PBMC）的分層液比重是  1.077±0.001  的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，犌W水性高，平均分子量為400，000，當密度為1.2g／ml仍未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。

主要試劑

1. 比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名為淋巴細胞分離液)。
2. Hank's液(無Ca^２＋、Mg^２＋)
3. 10％小牛血清RPMI1640
4. 0.2％臺酚蘭染色液，用生理鹽水或等滲的PBS配制。
5. 肝素用Hank's液或生理鹽水稀釋成500單位／ml，人外周血肝素用量約為50單位／1毫升血。
試劑配制：

1. Hank's液(無Ca^２＋、Mg^２＋)配制法
　　　　NaCl 8.0克
　　　　KCl 0.4克

　　　　Na_２HPO_４·12H_２O 0.12克
　　　　KH_２HPO_４　　　　　　　　0.06克
　　　　葡萄糖　　　　　　　　　　1.0克
　　　　雙蒸水　　　　　　　　　 1000毫克
　　　　1％酚紅液　　　　　　　　　 2毫克

將上列成分混合后溶化，分裝于500毫升鹽水瓶內，8磅15分鐘滅菌，4℃冰箱保存，臨用時調PH至7.3～7.6。

2. 細胞分層液配制法
　　　　9％聚蔗糖　　　　　　　　　24份
　　　　34％泛影葡胺　　　　　　　 10％
混合，測比重為1.077～1.078，G５玻璃濾器過濾除菌。４℃冰箱保存備用。

3. 磷酸緩沖液(PBS)
　　原液:
　　A液: 0.2M NaH_２PO_４溶液
　　　　 NaH_２PO_４　　　　　　　　　　27.6克
　　　　或NaH_２PO_４·2H_２O 　　　　　　31.2克
　　　　蒸餾水溶解至　　　　　　　　1000毫升
　　B液：0.2M Na_２HPO_４溶液
　　　　 Na_２HPO_４·12H_２O 　　　　　　71.6克
　　　　蒸餾水溶解至1000毫升　

各種不同PH值PBS的配法
───────────────────────────────────────
　PH　　　　　7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
───────────────────────────────────────
A液(ml)     39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5
B液(ml)     61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5
───────────────────────────────────────
　　舉例: 　0.1M 　PH7.2PBS
　　　　　　A液　　　28毫升
　　　　　　B液　　　72毫升
　　　　　加蒸餾水　 100ml

4. 血球保存液
　　葡萄糖　　2.05克　枸椽酸鈉　　0.8克
　　氯化鈉　　0.42克　蒸餾水　　 100毫升
將上述成分混勻，略加溫使其溶解，分裝小瓶(100毫升)。經10磅、10分鐘高壓滅菌。4℃保存備用。

5. RPMI-1640培養液:

　　　　RPMT-1640(FLOW公司出品)　　　　1袋
　　　　三蒸水　　　　　　　　　　　 1000毫升
電磁攪拌30分鐘：1N　HCl調PH7.2～7.4(約加2.5毫升)，過濾除菌，作無菌試驗，4℃保存。
　　不完全RPMI-1640培養液:
　　　RPMI-1640　　　　　　　　　　　　　95毫升
　　　0.1M丙酮酸鈉　　　　　　　　　　　　1毫升
　　 0.2M谷氨酰胺　　　　　　　　　　　　 1毫升
　　　1M　Hepes 1毫升
　　　7.5％ NaHCO_３ 1毫升
　　　青霉素、鏈霉素(各1萬單位)　　　　　　1毫升
　　完全RPMI-1640培養液
　　　不完全1640培養液　　　　　　　　　　90毫升
　　　滅活胎牛(或新生牛)血清　　　　　　 10毫升

主要設備

1. 短中管、毛細滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。
2. 無菌干燥注射器針頭。
3. 碘酒，75％酒精，無菌棉球，鑷子，橡皮止血帶。
4. 血球計數板、顯微鏡、水平式離心機。

實驗材料

人外周靜脈血

實驗步驟

1. 在短中管中加入適量淋巴細胞分離液。

2. 取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。

3. 離心后管內分為三層，上層為血漿和Hank's液，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。此外，還含有血小板。

4. 用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入５倍以上體積的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分鐘，洗滌細胞兩次。

5. 末次離心后，棄上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2％臺盼蘭染液混合，于血球計數板上，計數四個大方格內的細胞總數。

　　單個核細胞濃度(細胞數／1毫升細胞懸液)＝
　　　　　　　　　4個大方格內細胞總數
　　　　　　　　　──────────　×　10４×2(稀釋倍數)
　　　　　　　　　　　　　　4

6. 細胞活力檢測：死的細胞可被染成蘭色，活細胞不著色。計數200個淋巴細胞。計算出活細胞百分率。
　　　　　　　　　　　　　活細胞數
　　　　　活細胞百分率＝──────　×100％
　　　　　　　　　　　　　總細胞數
用本法分離PBMC，純度在90％以上，收獲率可達80～90％，活細胞百分率在95％以上。

注意事項

1. 抽取人外周靜脈血時要注意無菌操作。
2. 操作全程應盡可能短時間內完成，以免增加死細胞數。
3. 用淋巴細胞分離液分離PBMC時，離心機轉速的增加和減少要均勻、平穩，使保持清晰的界面。
4. 小鼠、兔等動物淋巴細胞比重與人不同，應配制相應密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。