利用PCR分析酵母菌落主要用于確定酵母中是否攜帶目的DNA序列。
| 實驗方法原理 | 用 PCR 分析酵母菌落時，無需純化 DNA。本方案以單個酵母菌落的粗裂解液作為 PCR 擴增的模板，來確定酵母中是否攜帶目的 DNA 序列。 |
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| 實驗材料 | Taq DNA 聚合酶寡核苷酸引物DNA 標準參照物YAC 重組子的酵母菌株 |
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| 試劑、試劑盒 | PCR 緩沖液dNTP 溶液 |
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| 儀器、耗材 | 瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠微量離心管程控式 PCR 儀 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
10X 菌落 PCR 緩沖液
dNTP 溶液（10 mmol/L), 含有 4 種 dNTP ( pH 8.0，PCR 級）
MgCl2 ( 25 mmol/L)
2. 酶及其緩沖液
Taq DNA 聚合酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠
4. 核酸和寡核苷酸
寡核苷酸引物
DNA 標準參照物
5. 專用設備
微量離心管（0.5 ml)
儲存有所需 PCR 方案的程控式 PCR 儀
6. 載體和酵母菌株
攜帶有目的 YAC 重組子的酵母菌株
二、方法
1. 在一個無菌的 0.5 ml 微量離心管里，依次序加入下列物質：10X 菌落 PCR 緩沖液 2 ul，25 mmol/L MgCl2 1.2 ul，10 mmol/L dNTPs 0.4 ul，寡核苷酸引物 每個引物濃度為 10 pmol，Taq 聚合酶 5 單位（0.2 ul），H2O 加至總體系為 20 ul。
2. 用一個黃色的一次性移液器吸頭，吸取少量酵母菌落 ( 0.10~0.25 ul )，加入反應體系。
3. 將 PCR 管放進 PCR 儀內。按下面程序進行 PCR 反應。
4. 用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 PCR 產物。電泳應采用適宜大小的標準參照物。 收起 |
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| 注意事項 | 1. 設計引物很關鍵。一般如果是定向克隆，用載體上的通用引物即可。如果是非定向克隆（如單酶切或平末端連接），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑒定了，而且錯誤概率很低。PCR條件的選擇接近最佳，同時挑取的菌體不宜太多，否則會有非特異性擴增。
2. 使用的引物濃度不能太高，濃度過高會導致非特異性擴增，反應的循環數也不能太多，一般不超過25個。同時因為擴增的片段的GC含量問題，有的GC含量很低，有的又很高，導致菌落PCR不容易擴增出目的條帶，在此建議在設置PCR程序時以高GC的溫度為上限，每一循環降0.2度左右。 |
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