制備體外剪接反應用HeLa細胞核和胞質S100提取物實驗

HeLa 細胞

DTT 苯甲基磺酰氟 PBS 緩沖液

Eagle 懸浮培養基本培養基 玻璃勾架器 透析袋

―、材料與設備

所有的試劑均需用高質量高壓滅菌水配制，例如 Mill Q ( Millipore，Bedford，MA，USA ) 或者雙燕餾水。所有用于培養細胞的成分均需高壓滅菌，不耐熱的材料用 0.22 μm 過濾器過濾除菌。

1. HeLa 細胞懸浮培養

(1) 培養基：Joklik 修改后的 Eagle 懸浮培養基本培養基（ICN Pharmaceuticals 公司），或相當的培養基，這種粉末狀的培養基包含除血淸外的所有必須物質。用 Milli Q 水溶解粉末并過濾除菌，配制成 5X 儲備液，用過濾除菌水配制工作液并加入小牛血清至 終濃度為 50 ml/L，pH 約 7.0。

(2) HeLa 細胞：用適于在懸浮培養基中生長的細胞株，如 S-3 株。

2. 提取物的制備

試劑 (1) 和 (2) 儲存液應保存于 -20℃，在使用前再加入溶液 (3)~(6)。

(1) 1 mol/L DTT。

(2) 20 mg/ml（115 mmol/L ) 苯甲基磺酰氟（PMSF)，溶于乙醇。

(3) PBS：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，8 mmol/L Na₂HPO₄，1.5 mmol/L KH₂PO₄，0.5 mmol/L MgCl₂。

(4) 緩沖液 A：10 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0)，10 mmoI/L KCl，1.5 mmol/L MgCl₂，1 mmol/L DTT。

(5) 緩沖液 B：0.3 mol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，1.4 mol/L KCl，30 mmol/L MgCl₂。

(6) 緩沖液 C：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，0.6 mol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L EDTA，25%（V/V）甘油，0.5 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT。

(7) 緩沖液 D：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，100 mmol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA，20% ( V/V )甘油，0.5 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT。

(8) 40 ml Dounce 帶較松研杵的玻璃勾架器。

(9) 截留分子質量為 12000~14000 Da 的透析袋。

二、操作方法

1. HeLa 細胞懸浮培養

細胞于 37℃ 在轉動培養瓶中培養，細胞密度維持在 2X10⁵~5X10⁵。細胞倍增時間大約是 24 h，細胞密度可用血細胞計數器計數。

2. HeLa 細胞核提取物的制備

(1) 取對數生長期（4X10⁵~6X10⁵/ml，不超過 1X10⁶/ml）的 HeLa 細胞用低速離心機在 1800 g 離心 10 min，收集細胞。

(2) 用冰冷的 PBS 輕輕地重懸細胞，再離心，確定細胞沉淀的體積（PCV )。后面所有的步驟都應該在冰上或者在冷室里進行，所有的離心步驟應該在 4℃ 進行。

(3) 將細胞沉淀輕輕地重懸在 5 倍 PCV 的緩沖液 A 中，冰上放置 10 min，使細胞在低滲緩沖液中膨脹。

(4) 于 1800 g 離心 10 min，沉淀細胞。再用 2 倍 PCV 的緩沖液 A 重懸細胞。由于膨脹，細胞沉淀體積會加倍，計算時釆用原來的 PCV。

(5) 用 Dounce 玻璃勻漿器勻漿大約 10 次。細胞裂解的程度通過臺盼藍染色以血細胞計數器檢測，目標是 90% 的細胞裂解，但勻漿不要超過必需的次數。注意 HeLa 細胞核很大，并不比完整的細胞小多少。

(6) 裂解液轉入高速離心管中，于 1200 g 離心 10 min，用吸管小心取出上清加入一個量筒中以制備 S100 提取物。

(7) 在同一離心管中以 33000 g 離心 20 min，小心吸棄上清。

(8) 12 升 HeLa 細胞培養物獲得的濃縮胞核體積（PNV ) 通常為 9~15 ml。加 2 ml 緩沖液 C，旋動以使沉淀與離心管分離，但是不要使沉淀散開，將沉淀和液體轉移到帶刻度的一次性試管，測量體積，然后減去 2 ml 為估計的 PNV，加入更多緩沖液 C ( 含 0.6 mol/L KCl ) 使 KCl 的終濃度為 0.24 mol/L，其范圍應該為 0.20~0.25 mol/L。

(9) 將沉淀和緩沖液（還不要將沉淀重懸，否則溶液將變得黏稠且很難沒有損失地轉移 ) 轉移到一個干凈的 40 ml 玻璃 Bounce 勻漿器中，用一個較松的研杵勻漿幾次使之懸浮。勻漿 10 次應該足以制備勻質的懸液。

(10) 將勻漿轉移到一個或多個帶螺帽的高速離心試管中并輕輕晃動混合 30~45 min。

(11) 高速離心（約 33000 g，30 min）沉淀鹽洗過的細胞核，并小心地將上清轉移到一次性試管中，避免沉淀的污染。

(12) 用緩沖液 D 透析上淸兩次（通常用 1~2 L）。一次過夜，另一次至少 4 h。

(13) 33000 g 高速離心 20 min，去除透析過程中形成的沉淀，并小心地將上清（核提取物）轉移到一次性試管中。

(14) 將提取物以 0.1~1 ml 分裝到微量離心管中。將離心管放入液氮中快速冷凍，于 -70°C 或更低溫度儲存。

3. HeLa 細胞胞質 S100 提取物的制備

在等待操作1 "HeLa 細胞核提取物的制備" 中的步驟 (7) 的離心時，將第 (6) 步得到的上清進步處理可獲得 S100 提取物，它包括胞質成分和許多（但非全部）核成分，它在低滲緩沖溶液 A 中提取。

(1) 測量上請液的體積，加 0.11 倍體積的緩沖液 B，輕輕混合。

(2) 在超速離心管中以 100000 g 離心 1 h。

(3) 將上清轉入一次性試管中。

(4) 用緩沖液 D 透析 2 次，一次過夜，另一次至少 4 h。提取物的體積在透析期間顯著縮小，這是因為緩沖液 D 中含有的甘油使提取物濃縮。

(5) 33000 g 高速離心 20 min 去除不溶物質。

(6) 將提取物以 0.1~1 ml 分裝到微量離心管中，快速冷凍并如操作3 “HeLa 細胞核提取物的制備” 中的步驟 (14) 所述儲存。12 升培養物可制備胞質 S100 提取物 40~55 ml，總蛋白濃度為 10~15 mg/ml 提取物活性可保持數年之久。