制備色譜技術與操作（二）

1 制備用的流動相最好等級高一點，否則流動相中的雜質會影響LC-MS分析。
2使用餾分收集器時，延遲體積一定要計算精確，檢測器的響應時間設到最小，否則都會影響收集的純度和回收率。制備柱的流速一般與直徑的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速為1mL/min，9.4mm制備柱用1*（9.4/4.6）2, 大約為4ml/min。進樣量設到幾個mg應該基本沒有過載。進樣樣品濃度越高越好。假如進樣10mg，理論計算0.05%的雜質大約只有5ug，顯然濃度太低，最好是多做幾次，合并餾分然后濃縮后做LC-MS分析。
3 問： 我想用hplc分離一個簡單的多肽,我應該選用什么樣的流動相,還有他的梯度,還有選用什么樣的柱子
RP-HPLC,C18柱可以制備很少量的肽。如果用RP-HPLC，首先應該用同類型的分析柱子分析一下多肽含多少雜質，設置緩緩的梯度的分離樣品，在根據分析柱子跑出的峰形，逐漸放大純化的方法。
4  問：TFA在緩沖液中是不是只起到調節pH的作用呢？TFA的濃度越高基線的漂移越厲害，那是不是說它的濃度在緩沖液pH允許的情況下越低越好呢？
（1）TFA起到類似離子對的作用，一般濃度在0.05-0.1%，過高的濃度，會使溶液偏酸，長時間使用可能影響柱子壽命。（2）同時TFA可以抑制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型。有時0.1%TFA分離不好的話。可以考慮加大濃度到0.2%。但要注意用完后及時沖洗色譜柱。
（3）走梯度時，因為走成基線漂移，但對制備的影響不大。
5  問：樣品如果溶解度太低如何上制備HPLC？
（1） 了解一下樣品的性質,根據其酸堿性,極性等性質，通過調節溶劑的pH值等, 以達到較好的溶解度
（2）樣品可能某種晶型難溶，這樣可以加入其他溶劑（如丙酮等）以助溶。
（3）不是一定要用流動相來溶解樣品，對溶解度差的樣品，可以選擇甲醇，THF或DMSO等溶解樣品。特別是DMSO，對一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留，不會造成干擾。而且DMSO的洗脫能力很弱，一般不會影響峰型。
（4） 可以固體上樣。
6 問：多肽的分離制備,  如何上量？如何增大分離度?
反相HPLC應當是很好的分離小肽方法，用CH3CN或CH3OH：H2O（95：5）做流動相，看保留如何，若無保留，建議改用其他色譜方法進行分離。
關于多肽的分離，首先要知道它的分子量大小，然后選擇不同類型的填料，如孔徑的大小。我們先在分析柱（4.6MM內徑）上做一下實驗,找到最大的分離度,這一過程的難度是最大的,要不斷地改變流動相和固定相,然后再線性或非線性放大到制備,放大的倍數按分析柱的實驗結果。分離后可以通過冷凍干燥得到固體。
還可以考慮離子交換來分離多肽。
7   問： 做柱層析時（國產大孔吸附樹脂），怎么才能把洗脫液中的樹脂殘留物處理干凈？
大孔吸附樹脂在上使用前，一般需要進行處理，方法包括用色譜純的甲醇或乙睛洗到沒有吸收；或樹脂用乙醇浸泡2天，丙酮浸泡2天，然后用常規的酸，堿洗。再用丙酮回流二小時就可以用了。
8  問：由分析型液相轉為制備型液相，其色譜系統需作多大調整？是否可以按照柱體積折算只改變流速？其上樣量多大為宜？
（1）泵要換，流量要加大，壓力可不變或減少；流通池要換體積更大的。
（2）整個系統的管路要更換更粗的，否則壓力太大,而且特別容易發生堵塞。對流通池后的管路，最好增加反壓調節器，否則管路太短的話，反壓小會導致流通池氣泡，管路長的話會導致峰展寬。
（3）檢測器的響應時間和峰寬要設置合適，否則會導致收集時延遲體積的計算不準
(4)上樣量主要根據柱子的大小、樣品的濃度、制備是否根據分析條件放大（例如制備柱是否還用分析用填料）；一般上樣量與柱子直徑的平方以及長度成正比。
9  問：流動相中含有鹽時，收集液該如何除鹽？選用揮發性酸，堿或鹽（如醋酸銨）是否會在揮干溶劑或凍干過程中直接除去？
一般可以采用離子吸附的辦法去掉（可以參考離子吸附有關技術）。但也是稍微麻煩的事情，最好，不加加酸堿鹽，如果要加的話最好，要加揮發性的或者對產品或者檢測沒有干擾的。
可用G25脫鹽，它是安馬西亞出的一種葡聚糖凝膠。交聯度大孔徑小,對小分子的無機鹽保留較大,而對分子量較大的有機物沒有保留從而可以將鹽份脫除。另外采用揮發性的酸，堿時，一般會在干燥過程中直接除去，但如果樣品也有酸堿性，可能會與這些揮發性酸堿形成一定比例的鹽。
10 問：制備型柱子柱壓上升 柱效下降 怎么辦？
對高價值的制備柱來講，延長柱子壽命是很重要的。一般要注意保護柱子，一般來說，制備柱子一般需要保護柱配套。
下面是可能堵塞柱子的原因：
（1） 如果您所分離的樣品中雜質較多而您在上樣前沒有經過過濾（0.45微米），一些顆粒性雜質會積聚在柱頭造成柱壓升高，
（2） 也有可能是因為您所使用的流動向中含有緩沖鹽的原因，結晶或發生化學變化而堵塞。可以把柱子沖一沖。
（3） 流動相是否符合液相色譜的要求？是否過濾處理？
。柱子再生處理辦法如下：
（1）依次用水，甲醇，四氫呋喃，氯仿，甲醇來沖洗柱子，每種溶劑5-10個柱體積。（2）如果效果不明顯，將柱子按以上順序反沖，一般將大大降低柱子效果，不到不要沒有辦法才采用。
（3）如果效果還是不好，就需要打開色譜柱，超聲波清洗篩片（這樣也會使柱子效果下降）。必要時挖掉色譜柱內受污染部位，填入新的填料，還可用3個月。（填的時候小心，別重新污染柱子）
11 問：制備柱柱跑干了影響柱效嗎?
如果時間不長的話,可以用流動相多沖幾個小時.柱效不一定變化很大.如果時間太久,柱效一定變低. 具體造成影響有多大，要靠柱效測定來確定，而不是干柱時間的長短。如果跑干了，對于PUMP的影響可能還大些，所以最好先把管路中的空氣抽走再說。
一般說來，制備柱子跑干，屬于操作失當。柱子閑置不用時，最好沖入甲醇或其他有機溶劑，一定要把兩頭堵住密封，這樣保留的時間會較長。