前沿顯微成像技術專題——轉盤式共聚焦顯微鏡（2）

上一篇文章介紹了轉盤式共聚焦顯微鏡的基本原理和技術特點，本篇主要介紹一些不同的轉盤共聚焦系統。

常見轉盤共聚焦系統

目前市場上最常見的是由日本Yokogawa（橫河電機）公司生產的 CSU系列轉盤系統，主流轉盤共聚焦顯微鏡多使用的是這一系列。正如在前文中提到的，它由兩個同軸排列的針孔圓盤組成，中間裝有一個二向色鏡。上方圓盤的針孔中裝有菲涅爾微透鏡 (Microlens disk)，將光線聚焦通過下方針孔盤（pinhole disk）相對應的針孔，這些針孔位于微透鏡的焦平面上（圖1），這樣經過微透鏡聚焦的光再照射在樣品上。同理來自樣品的發射光經物鏡再聚焦到針孔盤上，再由分色鏡反射，經發射濾光片聚焦到相機上。因此來自一個針孔的照明光產生由同一個針孔收集的發射光。微透鏡盤的使用能夠顯著增加透光量，提高圖像信噪比；同時進一步減小了激光功率，降低光漂白，延長成像時間。

圖1 Yokogawa 轉盤系統原理示意 (from Zeiss Campus)

尼康轉盤共聚焦顯微系統使用的正是Yokogawa CSU系列，包括CSU-X1和CSU-W1（圖2）。CSU-X1掃描速度高達10000轉/分鐘，理論上最大采集速度為2000幀/秒。CSU-W1的掃描速度較慢，最大采集速度為200幀/秒，但視場幾乎比CSU-X1大4倍，可以使用更大視野的相機；還具有串擾低和近紅外光譜范圍更大的特點，能夠對活細胞內部更深層區域進行清晰成像；并支持雙相機，可以進行快速雙色定位成像。CSU-W1有50μm和25μm兩種尺寸的針孔，用于匹配不同倍數的物鏡。25μm針孔可以搭配低倍物鏡，視野更大，對比度更好。

在CSU-W1基礎上推出的CSU-W1 SoRa模式使用60x和100x的高倍物鏡，通過光學放大，微透鏡技術和反卷積將橫向分辨率進一步提升至120nm，實現轉盤式共聚焦和超分辨顯微成像的結合。

圖2 Nikon CSU-W1轉盤共聚焦顯微成像系統 （配 Prime 95B）

奧林巴斯 IXplore SpinSR10 轉盤共聚焦超分辨率成像系統（圖3）使用的也是CSU-W1，并通過光學變倍達到縮小針孔的效果，提高系統分辨率。再結合奧林巴斯超分辨率（OSR）技術，可將分辨率進一步提升到120 nm。該系統可以對細胞內深達100微米的區域進行成像操作。光毒性低，穩定性好，可以迅速創建3D超分辨率圖像數據，觀察到活細胞內部的動態變化。

圖3 奧林巴斯 IXplore SpinSR10 轉盤共聚焦超分辨率成像系統

其他轉盤共聚焦系統

微透鏡固然好，不過一般價格也相對較高，微透鏡的直徑還會限制單位面積內的針孔數量，與不同顯微鏡制造商提供的物鏡的數值孔徑也不一定能夠匹配。下面我們就介紹一些其他的轉盤共聚焦系統，供大家參考~

意大利CrestOptics 公司的X-Light系列轉盤系統（圖4）采用單轉盤設計，可以使用更為經濟的LED光源，具有壽命長，能耗低，產熱少的優點，對活細胞更加友好。該系統對針孔直徑，阿基米德螺旋數和螺旋模式都進行了優化，提高了抑制雜散光的能力，可以在一定程度上實現更高的光通量，提高系統的分辨率和信噪比。轉盤采用50μm針孔，并設計了Standard 和 Larger兩種針孔間距，較大的間距能夠降低串擾，適合厚樣本切片。X-Light V3最大能夠支持25mm對角線視野，方便大樣本成像。

圖4 兩種針孔間距的 CrestOptics X-Light V3 轉盤系統

另外還有一種非激光的共聚焦系統，來自Aurox公司的Aurox Clarity Laser Free Confocal（Aurox LFC，圖6），將轉盤和結構光照明相結合。激發光會通過一個反射罩（reflective mask）照射到樣品上，反射罩上有一些由不同比率和空間頻率的線組成的圖案，以適應不同物鏡。焦平面發射光主要來自受反射罩圖案激發的區域，因此會通過反射罩，而來自其他非焦平面的發射光將被反射（圖7）。因此我們會獲得兩張圖像：一張通過轉盤成像（WF+Confocal），帶有結構圖案；另一張通過轉盤反射成像（WF- Confocal）。將兩張圖像相減，就能去除非焦平面的干擾信號。該系統具有寬場和共聚焦兩種模式，光學切片能力與傳統的點掃描式共聚焦相當。

圖6 Aurox Clarity Laser Free Confocal

圖7 Aurox LFC 光路示意。如白色箭頭指示反射罩反射非焦平面的發射光，而來自焦平面的發射光可以直接通過反射罩

這種系統需要兩個單獨的相機成像，或在單個相機上同時成像，后者更容易進行校準和圖像處理。因此，大視野的sCMOS相機更加適合。另外，由于兩幅圖在信號強度上差異很大，也需要大動態范圍的sCMOS相機。

轉盤共聚焦的相機選擇

說了這么多，到底如何選擇最適合轉盤式共聚焦顯微鏡的相機呢？其實我們不難從轉盤系統的原理看出：由于透光率不高，相機靈敏度是首要考慮的參數。此外，高速和大視野的相機能夠幫助轉盤共聚焦系統達到最佳性能。這樣一來，背照式sCMOS相機就是它的最佳選擇啦！

為什么背照式 sCMOS 比 EMCCD 更加適合轉盤？

• 首先，QE高達95%的背照式sCMOS具有與EMCCD相當的靈敏度。但是，EMCCD不但需要定期進行增益校準，同時由于電子倍增引入的額外噪聲因素會降低總體信噪比，而像Prime 95B這樣的sCMOS相機則不會遇到這些問題。

• 其次，背照式sCMOS在分辨率，速度，視野，動態范圍等參數上都要優于EMCCD。常見的背照式sCMOS有6.5μm和11μm兩種不同的像元尺寸，可以分別與60x和100x的物鏡相匹配，達到最佳分辨率。而EMCCD像元較大，對樣品細節的分辨能力較差。

我們可以看到，與EMCCD相比，Prime 95B的圖像信噪比更高，并且可以對EMCCD看不到的樣品細節進行更清晰的成像（圖8）。

圖8 轉盤共聚焦顯微鏡下Prime 95B 和EMCCD成像效果對比。上：Prime 95B vs 512x512 EMCCD；下：Prime 95B vs 1024x1024 EMCCD。

最后讓我們來欣賞一下 Prime 95B 在轉盤式共聚焦顯微鏡下拍攝的圖像吧~

果蠅胚胎（Yokogawa spinning disk，60x，from Dr. Kevin O’Conner，NIH）

mCherry-EB3 標記的細胞（Yokogawa CSU-X1，100ms曝光，from Wittman Lab，University of California, San Francisco）

線粒體 (Green, 488nm) 和肌動蛋白絲 (Red, 566nm)（Yokogawa CSU-X1，63x，from Peter March, Bioimaging Facility，University of Manchester）

References

https://www.yokogawa.com/eu/solutions/products-platforms/life-science/spinning-disk-confocal/

https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/confocal-microscopes/csu-series

https://www.olympus-lifescience.com.cn/advanced-imaging-solutions/spinsr10/

https://crestopt.com/

https://www.bruker.com/cn/products/fluorescence-microscopes/opterra-confocal-microscopy/overview.html

http://www.aurox.co.uk/aurox-confocal-microscope-confocals.php