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  • 發布時間:2022-08-22 15:50 原文鏈接: 副溶血性弧菌的PCR檢測的介紹

      用于檢測V.p的PCR方法主要有任意引物PCR(abritrarilyprimedPCR,Ap-PCR)、針對任意引物PCR、多重PCR(muhiplex-PCR)、實時PCR(Real-timePCR)。

      1、任意引物PCRMatsumoto等采用任意引物PCR對V.p進行檢測。他們針對V。p的tdh基因和trh基因一段特異的序列,設計兩條引物,

      引物1:5--GGTGCGGGAA--3,

      引物2:5一GTTTCGCTCC一3,

      對1977~1998年所收集的227株V.p進行PCR。通過電泳分析發現,1996-1998年收集的22株血清型為03:K6菌株與1996年以前收集的03:K6血清型菌株基因序列有所不同,為03;K6血清型新出現的變異株,并最初出現在孟加拉國。這是目前最簡單的以基因為基礎的細菌亞分型方法。

      2、針對任意引物PCR由于臨床分離株絕大多數含有tdh基因,因此絕大部分研究者都根據tdh設計引物進行特異擴增。1993年,Lee等根據tdh基因設計引物,對36株TDH+株、89株TDH-株以及46株其他弧菌和腸道菌進行PCR檢測。結果顯示,36株TDH+株全部特異擴增出來,其余菌株都沒有擴增;而檢測靈敏度高,最低檢測量可至40pgDNA,并可直接檢測糞便標本,無需分離培養,方便快速。1999年,Kim等選擇toxR基因序列設計兩對引物,5’--GTCTTCTGACGCAATCGTTG--3和5’一ATACGAGTGGTTGCTGTCATG一3’,對14株V.p、14株其他弧菌進行PCR。結果顯示,14株V.p都得到一條368bp的特異擴增亮帶,而其他菌株沒有特異擴增。此外,Venkateswaran等選擇gyrB基因設計引物對V·p進行PCR、Cordova等選擇pR72H基因設計引物進行PCR,特異性、靈敏度都很好。

      3、多重PCR由于不是全部副溶血性弧菌都含;tdh基因或,trh。基因,所以只針對tdh或trh的單一PCR,有時會漏檢。多重PCR(multiplex-PCR)能全方位高效率地檢測Vpo1994年,Bej白等針對“、tdh、trh設計不同的引物對,在同一PCR反應體系內同時擴增tl、tdh、trh。結果顯示,所有的V。p都擴增出“基因,tl基因是V.p特異的;54%的V.p擴增出tdh基因;只有38.73%的V.p擴增出trh基因;該法靈敏度高,能把log牡蠣培養肉湯里10~100個V.p檢測出來。與其他常規生化方法相比,多重PCR更快速,僅8h就能完成檢測,結果更為準確、可靠,而且還可改進成定量競爭PCR,對標本中靶序列進行定量。

      4、實時PCR常規PCR檢測,需要從反應體系中吸取產物做電泳或Southern雜交等試驗進行鑒定,轉移過程中易污染,造成假陽性,而且耗費時間。1996年,Tyagi開創了一種實時PCR(Real-timePCP,)。實時PCR是在,PCR反應體系中加入標記有報告基團和淬滅基團的線性Taqman。探針或莖環型熒光分子信標探針,在墓因擴增過程中,與產物雜交,此時,報告基團和淬滅基團分開,根據能量共振轉移現象,報告基團發出熒光而被檢測。這種方法操作簡單,閉管檢測,減少污染,靈敏度高,并且可以在PCR結束或PCR過程進行同步定性或定量檢測,面且可以進行臨床大規模快速檢測。

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