功能基因cDNA3’末端的克隆

一．原理

(1) 以目的mRNA 為模板，使用Oligo dT-3sites Adaptor Primer 進行反轉錄反應，合成1st Strand cDNA。

(2) 使用含有KpnI、XbaI、BamH I 酶切位點的上游特異性引物和3sites Adaptor Primer進行PCR反應。

(3) 使用限制性酶（KpnI、XbaI或BamH I）對PCR產物進行酶切反應。

(4) 選用適當載體克隆PCR產物并進行DNA測序。

二．材料與方法
1 材料
肝臟RNA
2 儀器 、用具
PCR儀、0.2mlPCR管、移液器
3 試劑
(1) RNase Free H2O；10×RNA PCR Bμffer；MgCl2(5mM)；RNase Inhibitor(40μ/μl)；Oligo dt-3sites Adaptor Primer(2.5μM)；AMV Reverse Transcriptase XL(5μ/μl)
(2) ddH2O；10×PCR Bμffer；MgCl2(25mM)；3 sites Adaptor Primer(20μM)；TaKaRa Taq酶
4 方法
(1) 1st strand cDNA的合成
① 逆轉錄體系：
圖 4－1 3’-RACE 法原理

② 反應條件：30 ℃ 10min；55℃ 30min；95℃ 5min；5℃ 5min。
(2) PCR反應
① 1st PCR反應
a. 反應體系：

b．按以下條件進行反應：PCR擴增反應條件：94℃預變性3 min；然后進行30個循環反應，其溫度循環條件為：94 ℃ 變性1 min ，55℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min；循環結束后 72 ℃ 再延伸5 min。
② 2nd PCR
a．反應體系：反應

b．按以下條件進行PCR反應：PCR擴增反應條件：94℃預變然后進行30個循環反應，其溫度循環條件為：94 ℃ 變性1 min，1min，72 ℃ 延伸1 min；循環結束后72 ℃延伸5 min。c．反應結束后，取 PCR 反應液（5-10μl）進行 瓊脂 糖凝膠電
(3) 將2nd PCR 產物在 1% 瓊脂 糖凝膠上進行電泳分離。回收純化電泳pMD-18T載體，進行鑒定和序列分析（方法同實驗六、實驗七）。
(4) 獲得cDNA 3’末端序列后，將其與cDNA 的核心片斷進行序列拼接。