動物細胞基因組DNA的制備

實驗概要

本實驗介紹了動物細胞基因組DNA的制備原理及操作流程。本方法一般可從5×10⁷培養的非整倍體細胞（如HeLa細胞）中獲得大約200μg DNA。DNA的長度可達到100~150kb。20ml正常血的DNA產量約為250μg。

實驗原理

真核生物的一切有核細胞（包括培養細胞）都能用來制備基因組   DNA。真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細胞核內，因此，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般過程是將分散好的組織細胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質，得到的DNA溶液經乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。在提取DNA的反應體系中，SDS可破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，EDTA則抑制細胞中DNase的活性；蛋白酶K可將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。
從核酸樣品中去除蛋白質常用等體積平衡酚和氯仿：異戊醇（24：1）組成的混合物。其中氯仿可使蛋白質變性并有助于水相和有機相的分離，異戊醇有助于減少抽提過程中泡沫的形成。平衡酚的pH應在7.8以上，否則DNA會進入有機相。

主要試劑

1. PBS溶液：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄。配制：用800ml 水溶解8g NaCl，0.2g KCl，3.22g Na₂HPO₄·12H₂O，0.24g KH₂PO₄；用HCl將pH調至7.4；定容至1000 ml。高壓滅菌或過濾除菌，室溫保存。
2. STE溶液：0.15 M NaCl，10 mM Tris-HCl （pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。高壓滅菌。
3. 20% SDS：900ml水溶解200g電泳級SDS。加熱到68°C并用磁力攪拌器攪拌助溶。如果需要，加幾滴濃HCl調解pH為7.2。用水定容到1000ml。室溫保存，無須滅菌。
4. 蛋白酶K溶液（20mg/ml）：20mg蛋白酶K溶于1ml滅菌ddH₂O中，分裝-20℃保存。該儲備液在-20℃可穩定保存一年。
5. TE緩沖液：10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA。高壓滅菌。
6. 平衡酚：用0.5M Tris-HCl，pH8.0平衡。pH必須大約為8。
7. “酚/氯仿/異戊醇”溶液：25ml平衡酚, 24ml氯仿、1ml異戊醇混合。混合物上覆蓋一層100mM Tris-HCl（pH8.0）緩沖液，在不透光的瓶子中4℃保存1月。
8. 冷無水乙醇：-20℃貯存的分析純無水乙醇。
9. 10M 乙酸銨（NH₄Ac）：70ml水溶解77g乙酸銨，用水定容到100ml。用0.22μm濾器過濾除菌。密閉瓶中室溫保存。
10. 70%乙醇：用水稀釋無水乙醇配制。
11. ACD抗凝劑（用于新鮮血樣抽取或凍存血樣）：0.48% （m/V）檸檬酸，1.32% （m/V）檸檬酸鈉，1.47%（m/V）葡萄糖。

主要設備

1. 磁力攪拌器

2. 高壓滅菌鍋

3. 10ml注射器

4. 高速離心機

5. 低溫冰箱

6. 大口徑吸頭

實驗材料

哺乳動物培養細胞

實驗步驟

1. 收獲哺乳動物培養細胞
   1) 用胰酶消化收集單層培養細胞或離心收集懸浮培養細胞。
   2) 用PBS溶液重懸細胞，4℃ 2500rpm離心10 min。吸棄PBS溶液。
   3) 用TE緩沖液將細胞重懸至濃度為5×10⁷細胞/ml。
2. 獲取魚血液細胞
   1) 取一10ml注射器，吸入0.5ml ACD抗凝劑（ACD抗凝劑：血液=1:5）。
   2) 尾靜脈抽血，血液經ACD抗凝，置4℃冰箱。
   3) 血液在4℃靜置4h后，血細胞沉積。沉積的血細胞可立即用于DNA制備，或50μl分裝，-20℃短期保存或-80℃長期保存。
3. 取50μl TE細胞懸液或50μl沉積的魚血細胞，加入450 μl STE溶液，10μl 20% SDS（終濃度0.5％）和10 μl 20mg/mL蛋白酶K（終濃度400 μg/mL），輕輕顛倒混勻，55℃水浴消化3h或過夜。
4. 將溶液冷卻到室溫，加入等體積平衡酚，緩慢顛倒混合10min，12000rpm 離心15min。
5. 用大口徑吸頭（出口直徑為7.5px）將粘稠水相轉移到新離心管中。
6. 水相中加入等體積平衡酚，緩慢來回顛倒試管10min，12000rpm離心10min；用大口徑吸頭將粘稠水相轉移到新離心管中。
7. 水相中加入等體積“酚/氯仿/異戊醇”溶液，緩慢來回顛倒試管10min，12000rpm離心10min；用大口徑吸頭將粘稠水相轉移到新離心管中。
8. 重復“酚/氯仿/異戊醇”抽提1次。用大口徑吸頭將粘稠水相轉移到新離心管中。
9. 水相中加入等體積氯仿溶液，緩慢來回顛倒試管10min，12000rpm離心10min；用大口徑吸頭將粘稠水相轉移到新離心管中。
10. 轉移水相轉移到新離心管中，加入0.2體積的10M 乙酸銨和2倍體積室溫無水乙醇（若使用冰冷乙醇，會讓一些殘留的RNA也沉淀出來。），水平旋轉或輕緩反轉離心管，使溶液充分混勻，DNA會形成絲狀析出物。
11. 12000rpm離心10min，沉淀DNA。吸棄上清。
12. DNA沉淀中加入500μl 70%乙醇，顛倒試管使溶液充分接觸試管所有內壁，以洗去殘留的鹽。
13. 12000rpm離心10min，沉淀DNA。吸棄上清。
14. 敞開管口，使乙醇揮發干凈。
15. 依據DNA團塊的大小，加入50~200μl TE緩沖液，溶解DNA（45~55℃保溫有助于DNA溶解。DNA樣品也可以4℃過夜溶解。）。

注意事項

1. 室溫下使乙醇盡可能揮發干凈，但不要使DNA太干燥，否則極難溶解。

2. DNA溶液短期使用可在4℃存放，長期儲存應分裝后保存在-20℃或-80℃，但要避免反復凍融。