化學發光雙脫氧DNA測序實驗

實驗材料 DNA

試劑、試劑盒 生物素Tris·ClMgCl2DNA聚合酶dATPdCTPdGTPdTTP

儀器、耗材 熱循環儀尼龍膜濾紙離心機

實驗步驟

1.  在微量離心管中混勻下列試劑，配制DNA摸板混合物

（1）1 μg 單鏈DNA模板或1~3 μg 變性雙鏈DNA模板

（2）0.5 pmol 生物素酰化DNA測序引物

（3）2 μl 5×Bst反應緩沖液

（4）加水至11 μl

（5）加熱至70℃，然后在30 min 以上的時間內，慢慢冷卻至30 ℃

2.  當模板混合物冷卻的同時，各取2 μl 小份的A、C、T、G引物終止混合液，加于4個獨立的微量離心管或微量滴定板的孔中，然后做好A、C、G、T的標志。

3.  在65℃預熱盛有終止混合物的管子或滴定板。

4.  加入1 μl Bst DNA聚合酶于步驟1冷卻后的模板混合物中。

5.  步驟2準備好的每個引物終止混合物中，各加入2.5 μl 聚合酶/模板混合液，于65℃溫育5 min。

6.  用水將20×追加溶液貯液稀釋成1×追加溶液，往每個樣品管或孔中各加入2 μl 1×追加溶液，于65℃溫育5 min。

7.  各管或孔中加入4 μl終止溶液。

8.  準備好標準的0.2~0.4 mm 厚含8 mol/l 尿素的測序膠。

9.  加樣前，樣品于80℃溫育2 min，置于冰浴，加樣2~3 μl，電泳，監測示蹤染料的遷移。

10.  剪三張與凝膠大小剛好或稍大的Whatman 3MM 濾紙，剪下一片能蓋過凝膠需轉移 區域的尼龍膜。

11.  拆卸凝膠裝置，分開玻璃平板。

12.  將一張Whatman 3MM 干濾紙放于凝膠上，然后通過剝起濾紙小心將凝膠揭起。

13.  將貼著凝膠的濾紙，膠面朝上放在玻璃平板上。

14.  將尼龍膜浸沒TBE緩沖液中，或用噴水瓶噴射TBE緩沖液使之完全潤濕。

15.  小心將濕潤的膜放在凝膠上，用吸管或平滑的玻璃棒在膜上滾動以排去氣泡。

16.  在膜的上面放兩張Whatman 3MM 干濾紙，濾紙上放另一塊玻璃平板并在其上加以2~4 kg 重物，轉移1 h。

17.  分離測序膠/膜夾層，小心從凝膠上剝下膜，并用鉛筆在膜與凝膠接觸的一面作好標志，將膜放在濾紙上，晾干約10 min。

18.  使用紫外線交聯裝置，紫外透照儀或手恃式紫外燈，照射轉印膜以固定DNA，總紫外線照量為120 MJ/cm2。

19.  接著進行步驟20的操作或將膜放在兩層保鮮膜之間，在 4 ℃可保存6個月。

20.  將膜放入可加熱封閉的大袋子中，加入500 ml 封阻液Ⅰ，小心排去氣泡，密封口袋，放置10 min。

21.  按下述過裎處理膜

（1）200 ml  偶聯物緩沖液20 min

（2）500 ml  封阻液15 min

（3）500 ml  洗滌緩沖液Ⅰ10 min，3次

（4）500 ml  分析緩沖液2 min

（5）50 ml 二氧雜環丁烷檢測5 min

21.  從袋子中排出過量的檢測液，平整所有的皺折，重新密封口袋。

22.  室溫將包著的膜直接與X光感光片接觸使之曝光。