實驗概要
實驗利用化學發光酶免疫法測定了水產品中殘留氯霉素。
實驗原理
氯霉素(CAP)能抑制人體骨髓造血功能，引起人類再生障礙性貧血，粒狀白細胞缺乏癥，新生兒，早產兒灰色綜合癥等疾病。我國禁止在動物飼料中使用。免疫分析法操作簡單，快速，通常用來大規模篩選樣品。但目前常用的顯色ELISA(cELISA)的檢出限一般在0.1μg/L左右，而CAP的允許的最大殘留量(MRL)也在0.1μg/L,并且MRL還有下調的趨勢。因此cELISA方法難以達到檢測要求。而本研究建立的化學發光酶免疫檢測方法 (CLEIA)檢測對蝦組織中殘留的CAP,檢測靈敏度可達到0.01μg/L;檢測范圍為0.03～23.7μg/L,可滿足CAP殘留的檢測要求。
主要試劑
1. 發光底物液SuperSignalλ(美國Hyclone2Pierce公司)
2. 抗CAP鼠單克隆抗體(Abcam公司)，免疫原為CAP2KLH。
3. CAP系列標準溶液:由國家進出口商品檢驗檢疫研究所贈送，經HPLC測定的100μg/L標準儲液系列稀釋而成。
主要設備
1. LuminoskanAscent化學發光檢測儀
2. 可調式移液器
3. 8×12可拆發光檢測黑板(ThermoLabsystems公司)
實驗步驟
1. 競爭CLEIA(competitiveCLEIA,CLEIA)方法檢測CAP的建立
1) 0.2g/LCAP2BSA溶液，包被黑色檢測板，50μL/孔，4℃過夜;
2) 次日取出，回至室溫，PBST洗滌3次，加入20g/L的BSA 溶液，100μL/孔，封閉，4℃過夜;
3) 先加入0.0、0.01、0.05、……、31.25μg/L系列CAP標準溶液，20μL/孔，每個濃度重復5次，隨后加入1mg/L的一抗，30μL/孔，剩下孔加入50μLPBST,作為空白對照，室溫30min;
4) 洗滌后，加入1∶4000稀釋的 HRP2IgG,50μL/孔，室溫30min;
5) 加入發光底物，50μL/孔，LuminoskanAscent化學發光檢測儀里面穩定2min, 測425nm光強度，檢測時間1s。用四參數方程擬合標準曲線:LU/LU0=(A-D)/[1 (x/C)B] D。其中LU/LU0為各標準濃度的光強度(lightunit,LU)與0標準濃度的LU的比值;x為標準液或分析物濃度，A和D分別為0標準液的LU和空白對照的LU,C為ED50點的濃度，B為ED50點處的斜率。
2. 精確性和準確性測定
蝦洗凈后，去頭、去殼，取蝦仁為分析樣品。取4支10mL玻璃勻漿器分別編號為1#、2#、 3#、4#。稱蝦仁5g于4支玻璃勻漿器中，分別加入8、7.95、7.9和7.6mL乙酸乙酯，并于勻漿器中分別加入100μg/LCAP標準儲液0、 5、100和400μL,配成0μg/kg(陰性對照)、0.1μg/kg(低濃度)、2μg/kg(中濃度)和8μg/kg(高濃度)4個水平。勻漿30min,轉移至15mL離心管中，勻漿器用2mL乙酸乙酯沖洗，與勻漿液合并，4000r/min室溫離心10min。吸取上清液，在N2流下干燥。2mL正己烷溶解干燥物后，加入1mLPBST,劇烈混勻后離心。沉淀用1mL正己烷溶解，離心后合并。每個濃度6次重復，分別計算批間(連續測定4d)和批內相對標準偏差及回收率。