單克隆抗體的制備（二）

3 免疫策略

不同實驗室使用的免疫策略是不同的，很多免疫策略都同樣有效。 目的是擴大宿主體內抗原反應性 B 細胞的數量。體內每次接觸到蛋白質抗原，都會增加抗原反應性B 細胞的數量。在對抗原的再次應答中，產生的抗體量會增加，總的免疫球蛋白類別會從以IgM 為主轉變為以IgG 為主，特異性抗體的親和力增高。總體來說，體內的免疫應答越強 ，靶抗原反應性B 細胞數量越多，那么分離到能夠分泌所需結合能力和功能活性的抗體的雜交瘤細胞的概率就越大。體外方法進行免疫激活和B 細胞擴增還沒有顯示高度的可靠性。誠 然 ，對從免疫動物中分離的脾細胞在體外進行激活得到過很好的結果，這種方法制成的雜交瘤主要分泌IgM 單克隆抗體。

特定抗原的免疫原性受多種因素影響，但使用佐劑（第 3 章）可增強免疫原性。佐劑(來源于拉丁語adjuvare，是「幫助」的意思）作為抗原承載物可以阻止抗原的清除，延長抗原在體內刺激免疫系統的時間，募集細胞到抗原所在的部位，并因其能增強共刺激信號和激活免疫系統而刺激淋巴細胞增殖。前面已經介紹了幾種佐劑系統，包括弗氏佐劑，是主要的免疫佐劑，用了幾十年。然而，弗氏完全佐劑也可以引起不需要的副作用。因此，作為替代品，合成的油包水型乳化佐劑已被開發出來，可降低毒性（如 R ib i或 TiterMax)。此外，明磯可以和抗原一起形成共沉淀，具有低毒性，已經用于某些疫苗中。在某些情況下 ，使用弗氏佐劑不能產生針對特定表位的有效體液免疫應答，但是使用明礬卻可以。最后 ，來源于細菌的基因序列—免 疫 刺 激 性 C pG 寡核苷酸序列（含未甲基化的胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸）最近被用來增強固有免疫, 誘導樹突狀細胞、單核細胞和巨噬細胞成熟，引 起 T h l細胞介導的細胞免疫，刺 激 B 細胞增殖和免疫球蛋白合成，導致體內保護性免疫的產生[21』 22]。

典型的免疫策略依賴于抗原的反復刺激，以增強特異性免疫應答并使其成熟。表5.2 列出了 — 典型的免疫接種時間表。在這個例子中，抗 原（10?IOOjMg蛋 白 質 或 IO7個細胞)用弗氏完全佐劑乳化。等量的抗原和弗氏完全佐劑一起乳化成稠厚的乳劑，給小鼠、大鼠或倉鼠多點皮下注射（總 量 0 ?5?1.0 ml)。弗氏完全佐劑中經過熱處理殺死的分枝桿菌可以引起炎癥反應, 并募集淋巴細胞到抗原沉積的部位。 10?14d 后 ，經過初次免疫應答產生弱抗體反應（以低親和力的IgM 抗體為主）。典 型 的 免 疫 接 種 時 間 表

第一次加強免疫(第二次注射抗原)使用的是弗氏不完全佐劑（弗氏不完全佐劑不含熱處理殺死的分枝桿菌，而弗氏完全佐劑中含有；弗氏完全佐劑的重復刺激可導致肉芽腫的形成，所以重復使用弗氏完全佐劑是不適當的）。抗原和弗氏不完全佐劑的乳化物也是多點皮下注射。對蛋白質抗原的再次應答，將產生增強的體液免疫，與初次免疫主要產生IgM 類抗體相比，加強免疫產生的抗體中Ig G 類抗體的數量明顯增加。雖然第一次加強免疫后也可以檢測到有意義的免疫應答，我們仍然建議進行第二次加強免疫，它能刺激免

疫應答的成熟，進一步擴增抗原反應性B 細胞的數量，增加血清抗體的效價。第二次加強免疫后的8?10d，應該收集免疫后動物的血清，與免疫前血清一起比較對抗原的反應性 。類似的免疫接種時間表也可應用于用質粒D N A 進行的基因免疫接種。已經公開發表的免疫接種時間表有很多，它們在佐劑的選擇、注射體積、抗原濃度、劑量及接種次數方面均有不同。前面給出的時間表是一個在多種動物模型中均取得了良好免疫效果的免疫接種時間表之一。

免疫后動物血清的反應性應該以多種稀釋倍數，運用多種檢測系統來確定體液免疫反應的強度和性質。由于血清組分的復雜性，檢測時血清樣品的稀釋度通常應該大于1 : 50, 以減少非特異性結合。此 外 ，檢測時應該包括大于1 : 1〇〇〇, 甚至超過1 : 1〇萬的血清稀釋度，以便更好地了解體內免疫應答的產生情況。血清效價的定義是: 在任何篩選試驗中均能和抗原出現明顯的、可檢測到的反應的血清最大稀釋度的倒數。

根據免疫原性質的不同，有多種篩選方法可以選擇使用（在隨后的部分詳細討論），包括酶聯免疫吸附試驗(ELISA )、流式細胞術、免疫沉淀或功能性中和試驗。血清的抗體效價最好使用能夠監測抗體預期功能的試驗體系來評估。也就是說，如果制備的單克隆抗體是用來結合重組蛋白的，那 么 E L IS A 可能是最有效的篩選手段。然 而 ，如果制備的單克隆抗體是用來識別天然的細胞表面受體，那么篩選血清的方法就應該用流式細胞術或者用天然形式存在的抗原來篩選。重要的是要認識到，在一種試驗體系中有功能的抗體可能會在另外一些實驗體系失去結合活性。識別構象表位的抗體，在免疫印跡（Westernblot)中，由于蛋白質是變性的，可能不會出現結合反應；同樣，識別隱藏在球形蛋白內部線性表位的抗體，可能不能抑制該蛋白質的功能活性。因此，在設計免疫程序和選擇篩選手段時，對抗原的性質有清楚的認識及考慮制備抗體的用途是很重要的。通常, 如果免疫后血清效價> 1 : 1000, 建議繼續進行隨后的雜交瘤融合。如果血清效價< 1 : 1000, 應該繼續加強免疫以增強機體對抗原的應答。

有時，即便經過多次加強免疫，也只能檢測到很弱的免疫反應。雖然從那些低血清效價的動物也篩選到抗原特異性的雜交瘤細胞，但得到這種克隆的概率很低，并且通常是分泌 IgM 類抗體的雜交瘤細胞。在這些情況下，重新審查最初的免疫策略是明智的選擇，可以改變抗原的形式，或者所用佐劑的種類。使 用 C F A /IF A 作為佐劑不能誘導產生有效免疫應答的抗原，在換用明礬作為佐劑后可能會大大提高免疫原性。

免疫后動物經過檢測顯示有意義的血清效價（> 1 : 1000) 后 ，動物應該「休息」3?6周 。這段時間是讓增強的二次應答衰減，以便在最后一次接觸抗原后導致新的 B 細胞的活化和擴增。「休息」后的動物要接受最后一次融合前的沖擊免疫，抗原用無熱原的生理鹽水或磷酸鹽緩沖液稀釋 (總量 200uL) ，不含佐劑。沖擊免疫的最有效途徑是靜脈注射，可以將抗原直接輸送到脾臟，脾臟中新活化的 B 母細胞收獲后可用于做融合。如果抗原

不適合靜脈注射 (如抗原是顆粒狀的，或者含有的緩沖液成分可能有毒），可以采用不含佐劑的抗原腹腔內注射進行沖擊免疫。不適合做靜脈注射的成分包括弗氏佐劑、濃度大于0.1 % 的清潔劑/去垢劑，大 于 lmol/L 的尿素、內毒素、T ris 緩沖液、NaN3，或者超過生理濃度的緩沖液和鹽水。經靜脈注射沖擊免疫后 3d(經腹腔內注射沖擊免疫后 4d) ，收獲免疫脾細胞或淋巴結細胞用于融合。

3 免疫程序

3.1 培 養 基 和 骨髓 瘤細 胞

制備分泌抗體的 B 細胞雜交瘤細胞依賴于抗原反應性B 細胞與永生化的B 細胞腫瘤細胞（骨髓瘤細胞）的高效率融合、隨后的鑒定以及對能持續生長的能產生特異性抗體的細胞系的分離。對篩選了的雜交瘤細胞系的擴增培養需要很熟練的組織培養技術和對這些脆弱細胞的非常認真的照顧 [23]。雖然有多種不同的培養基和培養條件都可用于雜交瘤細胞的培養，但是在這里介紹一種可靠的方法，能夠得到顯著的結果（表 5. 3)。最好選擇營養豐富的培養基培養細胞，因為細胞融合過程，以及隨后的細胞擴增和低密度的亞

克 隆 ，對雜交瘤細胞都是很大的壓力。符 合 這 些 條 件 的 一 種 培 養 基 是 高 糖（4. 5 g/L )DMEM(也 可 使 用 RPMI-1640 或 IMEM)。 D M E M 中 加 入 10% ? 20% 的胎牛血清(FBS)、4 mmol/L 的 L-谷氨酰胺、l mm〇 l/L 的丙酮酸鈉、50U/m l 的青霉素、50ug/m l 的鏈 霉 素 和 SOu mol/L 的 2-巰基乙醇 (2-ME) ，就成了 DM EM 完全培養基。制 備 和 培 養 雜 交 瘤 細 胞 所 需 的 試 劑

由于細胞培養時間長，所有的培養基組分都應該用 0. 22p m 的過濾器過濾除菌，而且在 4°C 儲存的時間不能超過 2 周 。 F B S 優于其他來源的血清，因為它含牛的免疫球蛋白量 低 ，牛的免疫球蛋白可能會干擾后續抗體的篩選或純化。在用于雜交瘤細胞培養前，也應該對不同批次的 FBS(或血清替代品）進行篩查，因為不同批次的 F B S 促進雜交瘤細胞的 生 長 能 力 不 同 。所 有 的 試 劑 都 必 須 是 無 支 原 體 污 染 的 ，而 且 內 毒 素 含 量 低（<0.25EU/ml)。在 DM EM 培養基中添加L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉，可以支持細胞的旺盛生長 。抗生素是可選的；然而，由于雜交瘤細胞的培養需要好幾周時間的反復操作，因此，在培養基中添加對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌都起作用的抗生素是明智的。在支原體 染 的 情 況 下 ，用環丙沙星（ciprofloxation)(lO^g/ml)替代培養基中的青霉素和鏈霉素 ，至少培養5 代 。在培養基中加人2-M E 是有爭議的，因為其作用機理不明。雖然在沒有 2-M E 的情況下也能制備出雜交瘤，但是添加后對很多培養會有益處 。 一 旦在雜交瘤細胞的培養基中添加了 2-M E 后 ，就不能夠再將其從培養液中去除了，因為這樣做，可能會導致免疫球蛋白分泌或雜交瘤細胞生存能力的顯著下降。

最近對雜交瘤細胞培養過程的改進包括研制出無血清或完全不含動物蛋白的培養基 。這對下游的雜交瘤細胞大規模擴增和單克隆抗體的生產提供了很好的選擇。很多這樣的新型培養基已被用于雜交瘤細胞的高密度培養和簡化單抗的純化程序。但這些新型培養基在雜交瘤細胞的起始培養中的效果還有待證明。在很多情況下，隨著培養基中血清濃度的減少，抗體的產量會增加。

細胞融合后，培養的細胞要用藥物進行選擇，以清除那些未能融合形成雜交瘤細胞的骨髓瘤細胞。有很多篩選試劑可供選用，主要根據特定骨髓瘤細胞系特異的突變而定。HAT是最常用的篩選藥物，表 5. 1 中 所 列 的 骨 髓 瘤 細 胞 系 都 可 用 此 藥 物 進 行 篩 選 。HA T 可 通 過 多 種 商 業 途 徑 買 到 ，由 次 黃 嘌 呤（hypoxanthine， 100pm〇l/L) 、 氨基蝶呤(aminopterin， 0. 4jumol/L)和胸腺啼陡（thymidine，16jamol/L )組成。氣基蝶呤可以阻斷所有細胞內的嘌呤和嘧啶的從頭合成途徑。次黃嘌呤和胸苷可參與細胞內嘌呤和嘧啶的

補救合成途徑（圖 5.2 )。在雜交瘤細胞初始的生長及擴增過程中，可能需要添加一些額外的生長因子或補充物。雖然有些實驗室會使用由滋養細胞層(脾細胞或腹腔巨噬細胞）產生的條件培養基「 conditioned media」, 但 是 也 可使用提供IL-6 來源的商品化的添加物(Origen HCF， IGENInc.， Gaithersburg， MD)。如果要使用滋養細胞層，應該在使用前1?2d 將其接種在96孔細胞培養板中，每 孔 75/zl，含 4 X IO3 個腹腔灌洗細胞或IXl O4 個脾細胞 。這樣確保滋養細胞產生了細胞因子，有利于雜交瘤細胞的生長，同時也能讓研究者確認滋養細胞層是無污染的, 污染的滋養細胞會危及雜交瘤細胞的生長。另外，商品化的添加物應按商家推薦的濃度使用，一 般 是 1 % ?5%(體積比），可以在使用時直接添加到培養基中。養細胞和商品化的添加物在促進新形成的雜交瘤細胞生長的效果方面基本相同。

前面提到的許多小鼠和大鼠的骨髓瘤細胞系都具有永生化生長的特性并能用藥物進行篩選(表5. 1)。小鼠的骨髓瘤細胞系，最初都來源于由礦物油誘導Balb/c 小鼠產生的漿細胞瘤（MOPC21)，在體外經8-氮雜鳥嘌呤培養(P3K)和選擇后，獲得嘌呤核苷酸補救合成途徑中酶缺陷的克隆（HGPRT- ) ，同時也不分泌免疫球蛋白的重鏈或輕鏈。這些骨髓瘤細胞在培養基中可以連續生長。然而，在有選擇試劑（如氨基蝶呤、甲氨蝶呤或重氮絲氨酸)存在的情況下，核苷酸的從頭合成途徑被這些試劑阻斷，這 些 缺 乏 HGPRT酶的雜交瘤細胞由于不能使用核酸合成補救合成途徑而無法生存（圖 5.2)。因此，這些骨髓瘤細胞就成了能用選擇培養劑篩選雜交瘤的非常好的模型。圖 5. 2 HAT選擇培養的機制

骨髓瘤細胞應該裝入凍存管后儲存在液氮中，每次細胞融合解凍復蘇一管新細胞。確保凍存的骨髓瘤細胞沒有受到支原體污染非常重要，并且應該檢查不存在任何傳染性微生物，檢查方法和前面提到的篩選免疫原時用的方法一樣（小鼠抗體生產篩選試驗，MAPS)。骨髓瘤細胞在融合前的培養時間不應超過兩周，要始終保持細胞處于對數生長期 ，密度不超過IO6 個細胞/ml。骨髓瘤細胞通常用含i 〇 %FBS的 DMEM完全培養基培養（如前所述），每周傳代 3 次 ，密 度 為 2. 5 X IO4?10. OXlO4 個細胞/ml , 取決于不同骨髓瘤細胞的生長速度。常規地，應該取一些骨髓瘤細胞培養在含H A T 的選擇培養基中，以

確定是否所有的細胞都會死亡、是否這些骨髓瘤細胞被污染、選擇試劑是否有效等。在與抗原反應性B 細胞融合前，骨髓瘤細胞要用無血清培養基在4°C 條 件 下 洗 3 次 ，因為血清中蛋白質會干擾膜融合。用無血清的DMEM重懸骨髓瘤細胞，對其進行計數，調整濃度為I XlO7個細胞/ml, 放 在 4°C 。骨髓瘤細胞的活細胞比例應大于9 5 % 。