1、抗原準備
抗原(Ag)是指所有能誘導機體發生免疫應答的物質。即能被 T/B 淋巴細胞表面的抗原受體(TCR/BCR)特異性識別與結合,活化 T/B 細胞,使之增殖分化,產生免疫應答產物(致敏淋巴細胞或抗體),并能與相應產物在體內外發生特異性結合的物質。因此,抗原物質具備兩個重要特性:一是誘導免疫應答的能力,也就是免疫原性;二是與免疫應答的產物發生反應,也就是抗原性。很多物質都可以成為抗原,抗原可依據不同的分類方式分為以下幾類:根據抗原性質分為完全抗原和不完全抗原;根據抗原的來源分為異種抗原、同種異型抗原、自身抗原、異嗜性抗原;抗原還可分為內源性抗原、外源性抗原。在進行單克隆抗體制備過程中,很多物質都可以成為抗原,在常規的科研實驗中,科研者經常選用每只小鼠/大鼠每次注射 10～50μg 重組蛋白、偶聯多肽、偶聯小分子等作為抗原產生特異性的單克隆抗體。
2、細胞融合
細胞融合的方法有物理法(如電融合、激光融合)、化學融合法和生物融合法(如仙臺病毒),此處列舉化學融合法中的一種,即聚乙二醇融合法。聚乙二醇(PEG),在分子量為200～700時,呈無色、無臭的黏稠狀液體;分子量大于1000時,呈乳白色蠟狀固體;能溶于水、乙醇及其他許多有機溶劑,對熱穩定,與許多化學藥品不起作用。用作細胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4000者,常用濃度為50%,pH 8.0～8.2(用10%NaHCO3 調整),分子量小的 PEG,融合效應差,又有毒性;分子量過大,則黏性太大,不易操作。50%濃度,pH 偏堿時融合效應最高。也有采用30%～50%濃度的 PEG 加上10%二甲亞砜。不同批號的 PEG,即使分子量相同,但融合率卻有明顯差異,選用時必須注意。每批都必須進行細胞毒性試驗后方可應用。要買高純度的,一般選供氣相色譜用的 PEG。
細胞融合的關鍵:技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如,供者淋巴細胞沒有查到免疫應答,這必然是要失敗的。融合試驗最大的失敗原因是污染,融合成功的關鍵是提供一個干凈的環境,以及適宜的無菌操作技術。
3、雜交瘤細胞
克隆化的細胞可以在體外進行大量培養,收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過體外培養法得到的單克隆抗體有限,其不能超過特定的細胞濃度,且每天要換培養液。而體內雜交瘤細胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細胞具有從親代淋巴細胞得來的腫瘤細胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠(無胸腺的裸鼠),雜交瘤細胞就開始無限地繁殖,直至宿主死亡。產生腫瘤細胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體,這種抗體的效價往往高于培養細胞上清液的100～1000倍。利用免疫抑制劑,如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細胞血清等,可以加速和促進腫瘤的生長。
4、動物免疫
單克隆抗體制備的宿主動物一般選用 Balb/c 小鼠,也有一些公司聲稱開發出了兔的單克隆抗體制備技術,目前暫無具體的優劣比較結果,但是鼠單抗的應用范圍還是相當廣泛的。
免疫原用無菌鹽水稀釋并與佐劑混合,腹腔注射抗原與佐劑徹底混勻后形成的穩定乳狀液,在免疫原提供持續的免疫應答基礎上進行加強免疫。
5、克隆化方法
經過抗體測定的陽性孔,可以擴大培養,進行克隆,以得到單個細胞的后代分泌單克隆抗體。克隆的時間一般來說越早越好。因為在這個時期各種雜交瘤細胞同時旺盛生長,互相爭奪營養和空間,而產生指定抗體的細胞有被淹沒和淘汰的可能。但克隆時間也不宜太早,太早細胞性狀不穩定,數量少也易丟失。克隆化的陽性雜交瘤細胞,經過一段時期培養之后,也還會因為細胞突變或特定染色體的丟失,使部分細胞喪失產生抗體的能力,所以需要再次或多次克隆化培養。克隆化次數的多少由分泌能力強弱和抗原的免疫性強弱決定。一般來說,免疫性強的抗原克隆次數可少一些,但至少要3～5次克隆才能穩定。克隆化的方法很多,包括有限稀釋法、顯微操作法、軟瓊脂平板法及熒光激活分離法等。