單克隆抗體腹水制備實驗——雜交瘤細胞接種

高滴度的單克隆抗體的制備可以通過在小鼠的腹腔內接種能產生 MAb 的雜交瘤細胞，從而產生腹水來獲得。腹水可收集幾次，經熱滅活、滴定后儲存。

裸鼠（6～8 周齡　無特定病原體／注射了鼠鼠雜交瘤細胞的同系宿主）目的雜交瘤

完全DMEM-10培養液（含10mmol／L HEPES 及1mmol／L丙酮酸鈉）PBS／HBSS（無菌且不含 FCS）

20-G／22-G注射針頭18-G 注射針頭175cm2組織培養瓶50ml無菌聚丙烯錐形離心管15ml無菌聚丙烯錐形離心管

1. 用 20-G 或 22-G 的注射針，往小鼠腹腔內注射降植烷，每只鼠 0.5～1 ml，1 周后接種細胞。

2. 在 175 cm² 培養瓶中加完全 DMEM - 10 / HEPES /丙酮酸鈉培養液，進行雜交瘤細胞的培養，使細胞生長至對數期。

3. 將培養液轉入 50 ml 錐形離心管中，室溫下 500 g，離心 5 min。棄上清。

4. 細胞重懸于 50 ml 無菌的 PBS 或 HBSS （ 不含 FCS ） 中洗滌。于室溫下 500 離心 5 min , 棄上清。重復 2 次，然后細胞重懸于 5 ml 的 PBS 或 HBSS 中。計數細胞，通過臺盼藍排除法確定細胞活力，細胞應該有接近 100 % 的存活力。

5. 用不含 FBS 的 HBSS 或 PBS 調整細胞濃度至 2.5 × 10⁶ 細胞/ml。用一個 10 ml 的無菌的帶 22-G 針頭的注射器，對裸鼠進行腹膜內注射 1 ml 細胞，同時注射 3 個裸鼠。等待腹水形成（1～2 周）。

6. 收獲腹水。一只手抓住并固定小鼠，使其腹部皮膚繃緊。另一只手將一只 18-G 的針頭插入小鼠腹腔 1～2 cm 深。進針部位為左下腹或右下腹，以避免刺入鼠上腹部的重要器官，以及腹中線處的主要大血管，將腹水滴入一只無菌的 15 ml 聚丙烯錐形離心管中。

7. 如果腹水出現凝塊，可用一小木簽沿著凝塊的周圍（位于凝塊與管壁之間）挑一下凝塊使之解體，然后再離心。凝塊可能會粘在小木簽上然后移走，也有可能一直在管內離心后組成沉淀。

8. 在室溫下，1500 g，離心腹水 10 min, 收集上清，棄沉淀，將腹水存放于 4℃，直到收集腹水的工作完成（在 1 周內）。

9. 讓小鼠再次積累腹水（2～3 天），再次收獲腹水。重復這個過程直到再沒有腹水產生可供收集，或者小鼠健康狀況不佳。此時，可處死小鼠。

10. 把在幾天內收集到的腹水匯集到一起，于 56℃ 水浴 45 min 進行熱失活。如果凝塊形成，可參照步驟 7 中方法去除之，然后再離心。

11. 采用適當的方法檢測腹水中的 MAb 的滴度。MAb 的飽和濃度（最大活性）應該達到 0.5 % 或更高稀釋度。MAb 滴度偏低的原因常為雜交瘤不穩定，從而停止產生 MAb, 或者由于雜交瘤在體內連續多次傳代（2 次以上）所造成的。

12. 按大于 1:10 的比例稀釋 MAb，并通過 0.45 濾膜濾過除菌。分裝并凍存于 -70℃, 避免反復凍融，可凍存數年之久。如果腹水不是用來進行生物測定，那么可加入疊氮鈉至 0.02 % 的終濃度。

1. 在步驟 7 注射小鼠之前，檢測上清中 MAb 的活性（如 ELISA），或此步驟最好在細胞擴增之前進行。

2. 為避免出現將病原體引入嚙齒動物的危險，用抗體產生分析法對細胞進行病原體檢測不要稍有腹水就穿刺，應等 3～7 天腹水增高時再收集以獲取最多的量。每只鼠通常可收集到 5～10 ml 腹水（有時可多于 40 ml）。

3. 如果小鼠一點腹水也未產生就死亡了，特別是接種后 2 周內就死亡，那么再次進行小鼠接種時可注射少一些細胞。如果接種 2 周后小鼠不產生腹水而健康狀況良好，那么再次接種時可以給這些小鼠以及那些注射了降植烷而未接種過細胞的幼鼠多注射一些細胞。如果形成實體瘤，那么可將這些實體瘤細胞制成懸液并注射接種到另一只注射過降植烷的小鼠腹腔內。即使只產生少許腹水，這些腹水都可以轉移接種到另一只鼠的腹腔內（大約 0.5 ml/鼠），這樣就應該會產生大量的腹水。

4. 有時腹水太多，壓力太大，以致針一刺入，腹水就大量噴射出來，因此在刺入腹膜腔之前應確定針的出口確實對準了收集離心管口。

5. MAb 的飽和濃度（最大活性）應該達到 0.5％ 或更高稀釋度。MAb 滴度偏低的原因常為雜交瘤不穩定，從而停止產生 MAb, 或者由于雜交瘤在體內連續多次傳代（2 次以上）所造成的。