單抗糖基化調控之參數篇(下)

　　 關鍵質量參數是單抗仿制藥研發的標桿，包括糖基化修飾、聚體、電荷異質性等，其中如糖基化修飾對單抗的生物活性、免疫原性、藥物代謝動力學、構象、穩定性及溶解度具有重要的影響。細胞培養過程中細胞所處環境，如pH、溫度、滲透壓、溶氧等參數會影響到單抗糖基化表現，本文從pH著手就文獻中不同pH設置及調節pH時的pCO2水平和不同的堿液對糖基化影響的研究進行了簡要總結。

　　pH是細胞培養過程中重要的參數之一，其對細胞生長、蛋白生產及蛋白質量有不容忽視的作用，CO2作為pH調節控制的重要組成部分近年來也慢慢引起了研究人員的重視，血氣分析儀在細胞培養中的普遍使用也為研究CO2對細胞表現的影響帶來便利。

　　Brunner的團隊通過新型分離控制策略在CHO細胞中研究了單因素pH(6.8、7.0和7.2)、pCO2(37、94和150 mmHg)、pO2及其交互作用對細胞生長及蛋白質量的影響，在新型的分離控制策略中pH采用HCL和NaOH進行調節，pCO2進行離線調控。在對蛋白N端糖基化分析后發現半乳糖化、唾液酸化和巖藻糖化(G1、S1、aF1)均在一定范圍內變化，G1 25%-30%，S1 0.5%-1.5%和aF1 4%-8%。

　　如圖1所示，半乳糖化、唾液酸化和巖藻糖化隨培養參數的改變而變化，且當pH為7.2時，S1和aF1水平最高，且S1與Man8具有相關性(圖1C)；而G1隨pH和pCO2的變化較為復雜，當pH為7.2且pCO2為150 mmHg時，G1水平最低為21%，而當pH為6.8且pCO2為150 mmHg時，G1水平最高為31%，pH為7.0且pCO2為94 mmHg時，G1水平為30%；由此可推斷出，當pH和pCO2共同作用于細胞時，pH為主導作用，且當pCO2達到150 mmHg的高水平時，不利于蛋白半乳糖化。由圖1 D可知，高甘露糖糖型(M6和M8)與pH和pCO2基本處于正相關的趨勢，當pH分別為6.8和7.2時M6和M8分別最高。

圖1 pH、pCO2、pO2及其交互作用對蛋白糖基化的影響(圖表來源于參考文獻1)

　　Matthias的團隊研究得出，提高pH可以促進唾液酸化水平，但有學者的結論恰恰相反。Ivarsson等在雜交瘤細胞HFN 7.1生產IgG1體系中發現當pH增加時，半乳糖化(G1)和唾液酸化(S1)會有所降低，而G0F的水平會增加，如圖2所示。且當體系pH從6.8升高到8.0時，G1水平從0.43降低到0.24，S1水平從0.15降低到0.08，接近50%的降低比例，而巖藻糖化(F1)水平基本不變(0.99→0.94)(文中數據未體現)。關于pH變化對糖基化影響的機理，Ivarsson結出的解釋是pH影響了體系中銨離子水平，進而影響到高爾基體內的糖基轉移酶，因此影響到糖基化水平。

圖2 不同的pH對IgG1糖基化的影響(圖表來源于參考文獻2)

　　不同學者認為，pH對蛋白糖基化的影響是不一樣的，可以說是case-by-case的情況。Trummer等的實驗結果認為當pH在6.8和7.3之間變化時，對EPO-FC唾液酸化幾乎無影響。Muthing等發現，培養體系的pH增加會提高IgG3的G2F水平及巖藻糖化。Yoon等研究結果表明，提高體系的pH可以降低Epo的唾液酸化水平。

　　Borys等在CHO體系中研究了pCO2及用于調節pH的堿對蛋白唾液酸化的影響，實驗過程中采用的pCO2范圍有20-40 mmHg、40-80 mmHg及140 mmHg，堿有兩種：碳酸鈉和氫氧化鈉，并且Borys將唾液酸分成Neu5Ac和Neu5Gc(非人類表達，但其免疫原性還不明確)兩種進行研究。

　　在研究pCO2的影響時，保持體系中的pH在6.85-6.95，且是在D3天或D6天開啟pCO2控制，使其保持在低(20-40 mmHg)、中(40-80 mmHg)和高(140 mmHg)三個水平，其對細胞表現及蛋白唾液酸化的影響如圖3所示。收獲時，當pCO2控制在20-80 mmHg水平時Neu5Gc含量為0.13，而當在D3天或D6天將pCO2控制在140 mmHg時Neu5Gc含量為0.07。而Neu5Ac水平隨pCO2的變化并不明顯，低水平pCO2時為0.78，高水平pCO2時為0.75。就總唾液酸水平講，高pCO2時為0.82，低pCO2時為0.91，即維持一定的pH并提高pCO2水平時可以降低蛋白的唾液酸化。Zanghi等學者的研究也表明提高pCO2水平會降低蛋白的唾液酸化，pCO2對唾液化表現不同的影響因素較為復雜，有研究稱當pCO2水平高過110 mmHg時對細胞具有毒性，高水平的pCO2可能會影響細胞內的CMAH或NADH水平。

圖3 控制不同的pCO2水平對細胞表現及蛋白唾液酸化的影響(圖表來源于參考文獻3)

　　在對采用不同堿調控pH對蛋白唾液酸化的影響中，碳酸鈉(Sodium Carbonate)較氫氧化鈉(Sodium Hydroxide)對體系滲透壓的影響均低于6%，且pCO2基本均維持在60 mmHg。Borys等發現使用碳酸鈉時較氫氧化鈉的唾液酸化水平高，如圖4所示，不論是Neu5Ac和Neu5Gc水平，當使用碳酸鈉作為堿液時均較氫氧化鈉為堿液時水平高(0.90→0.80、0.15→0.10)，同時當碳酸鈉作為堿液時非唾液酸化水平也有所降低。兩種類似的體系中造成唾液酸含量不同的原因，Borys認為采用碳酸鈉作為堿液時引起唾液酸轉移酶活性的升高，進而促使Neu5Ac和Neu5Gc水平提高，但要具體確定其機制還需更多的實驗研究。

圖4 碳酸鈉和氫氧化鈉調控pH對細胞表現及蛋白唾液酸化的影響(圖表來源于參考文獻3)

　　參考來源：

　　1. Investigationof the interactions of critical scale-up parameters (pH, pO2 and pCO2) on CHObatch performance and critical quality attributes；

　　2. Evaluatingthe impact of cell culture process parameterson monoclonal antibodyN-glycosylation；

　　3. Effectsof Culture Conditions on N-Glycolylneuraminic Acid (Neu5Gc) Content of a RecombinantFusion Protein Produced in CHO Cells。