單核苷酸多態性（SNP）實驗

單核苷酸多態性（SNP）實驗

液氮PBSGA緩沖液GB緩沖液蛋白酶K無水乙醇蛋白液漂洗液

離心管離心機廢液收集管吸附柱水浴鍋分光光度計低溫冰箱

一、DNA抽提

1.  取新鮮肌肉組織約100 mg，PBS漂洗干凈，置于1.5 ml離心管中，加入液氮，迅速磨碎。
 

2.  加200 ul 緩沖液GA，震蕩至徹底懸浮。加入20 ul 蛋白酶K（20 mg/ml）溶液，混勻。
 

3.  加220 ul  緩沖液GB，充分混勻，37℃消化過夜，溶液變清亮。加220  ul 無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。
 

4.  將上述一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB 中，（吸附柱放入廢液收集管中）12 000 rpm 離心30 秒，棄掉廢液。
 

5.  加入500  ul  去蛋白液GD（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm 離心30 秒，棄掉廢液。
 

6.  加入700  ul 漂洗液GW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm離心30 秒，棄掉廢液。加入500 ul 漂洗液GW，12 000 rpm 離心30 秒，棄掉廢液。將吸附柱CB 放回廢液收集管中，12 000 rpm 離心2 分鐘，盡量除去漂洗液。
 

7.  將吸附柱CB 轉入一個干凈的離心管中，加入100 ul 洗脫緩沖液（洗脫緩沖液應在60-70℃水浴預熱），混勻，室溫放置15 分鐘，12 000 rpm 離心30 秒。洗脫第二次，將洗脫緩沖液50  ul 加入吸附柱中，室溫放置15 分鐘，12 000 rpm 離心30 秒。
 

8.  采用Beckman DU 640 spectrophotometer 檢測提取到的基因組DNA 濃度，在OD₂₆₀ 處有顯著吸收峰。同時檢測純度，OD2_60/280 的值應為為1.7-1.9。
 

9.  從原液中取出相應體積DNA 溶液，稀釋致50 ng/ul，原液置于-70℃保存，稀釋液置于-20℃保存。
 

二、 PCR擴增目的片段
 

1.  按相關的試劑說明在標準反應管中準備反應體系，典型的PCR反應體系如下（20 ul體系）：
 

2.  向左扳動儀器蓋子上的手柄，揭開儀器蓋子，小心放置樣品管于儀器的相應樣品孔中，輕輕蓋上蓋子，將頂部的旋鈕慢慢旋緊，讓熱蓋緊密接觸樣品管，樣品放置完畢。
 

三、 在T1型PCR儀上編輯一個程序
 

1.  按[C programs]進入編輯模式。要在主目錄中創建一個程序請按[D enter]。要進入一個子目錄，用→鍵將光標向右移動，然后用↑↓鍵選擇一個子目錄。按[D enter]進入選擇的子目錄。
 

2.  輸入程序中要求的溫度：用[D enter]確認溫度。為其輸入時間，用小數點來間隔。順序為h.m.s。用[D enter]確認時間設置，或者用光標鍵移動到下一個區域。＃表示循環的次數。設定循環值=總循環值-1，即，總循環數為30時應輸入“29”。用[C pgm ok]來儲存一個完整的程序。程序數據永久的儲存在記憶中。
 

四、運行程序
 

按[B start/stop]選擇一個程序。用→↑↓鍵選擇一個子目錄，或者用[D enter]進入主目錄。輸入您想要啟動的程序的號碼。或者，按[A list]在該子目錄中的所有程序的列表中選擇一個程序。用↑↓鍵在列表中滾動選擇。用[D enter]確認用強光突出的程序。按[D start]啟動程序。
 

五、控制測試過程
 

運行過程中，按A按鈕，可以獲得程序剩余的時間信息。運行完成后，按STOP按鈕終止實驗，按YES確認終止。小心旋開熱蓋，按照放置樣品的操作順序，打開蓋子，取出實驗樣品，再蓋上蓋子，關閉電源，本次實驗結束。
 

六、 PCR產物測序
 

由專門負責測序的服務公司完成。
 

七、數據分析
 

少量可人工讀取，大量可軟件讀取。比對發現的SNP在基因組中的位置：重點是啟動子區、外顯子區域（包括編碼區的cSNP及5'及3'UTR）、剪切邊界等，密碼子的改變是否導致氨基酸的改變：錯義突變、無義突變、終止突變。
 

1.  為保證待測目的區域測序真實可靠，引物設計應該使待測目的區域邊界距離上下游引物至少各50 bp；
 

2.   引物設計建議使用在線方式，以保證成功率；
 

3.  為保證測序敏感性，PCR產物片段大小應在250 bp－650 bp范圍；
 

4.  為方便實驗，建議引物合成時分裝成1 o.d/管，方便將PCR與測序的引物分開；
 

5.  為保證引物的特異性，建議引物設計后在NCBI上blast確認；
 

6.  為防止降解，PCR產物應盡快測序，否則應該保存在-20℃，且時間不宜過長；
 

7.  為保證結果真實性，建議對關鍵點進行反向測序確認。

SNP自身的特性決定了它更適合于對復雜性狀與疾病的遺傳解剖以及基于群體的基因識別等方面的研究：

1、 SNP數量多，分布廣泛。據估計，人類基因組中每1000個核苷酸就有一個SNP，人類30億堿基中共有300萬以上的SNPs。SNP 遍布于整個人類基因組中，根據SNP在基因中的位置，可分為基因編碼區SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs）、基因周邊SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）以及基因間SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三類。

2、 SNP適于快速、規模化篩查。組成DNA的堿基雖然有4種，但SNP一般只有兩種堿基組成，所以它是一種二態的標記，即二等位基因（biallelic）。 由于SNP的二態性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的長度，這就利于發展自動化技術篩選或檢測SNPs。

3、 SNP等位基因頻率的容易估計。采用混和樣本估算等位基因的頻率是種高效快速的策略。該策略的原理是：首先選擇參考樣本制作標準曲線，然后將待測的混和樣本與標準曲線進行比較，根據所得信號的比例確定混和樣本中各種等位基因的頻率。

4、 易于基因分型。SNPs 的二態性，也有利于對其進行基因分型。對SNP進行基因分型包括三方面的內容：（1）鑒別基因型所采用的化學反應，常用的技術手段包括：DNA分子雜交、引物延伸、等位基因特異的寡核苷酸連接反應、側翼探針切割反應以及基于這些方法的變通技術；（2）完成這些化學反應所采用的模式，包括液相反應、固相支持物上進行的反應以及二者皆有的反應。（3）化學反應結束后，需要應用生物技術系統檢測反應結果。

來源于郜金榮《分子生物學》化學工業出版社，2011