單細胞凝膠電泳技術影響因素的分析

單細胞凝膠電泳（SCGE）又稱“彗星”法，是一種操作簡便、快速、敏感性高的DNA損傷與修復的檢測技術。盡管此法無需復雜的實驗條件，但在建立過程中可能受諸多因素的影響而難以得到較理想的結果，我們就其主要的影響因素作如下分析。

1.瓊脂糖凝膠薄板的制備：

該實驗需要制備兩層瓊脂糖凝膠薄板，應注意瓊脂糖的濃度、制備時間和溫度。第1層是緊貼冰凍玻片砂面的1%正常凝點（42±2）℃的瓊脂糖凝膠，吸取85μl制成面積為18mm×18 mm，厚度為0.25mm的凝膠。

然后置4℃存放約20分鐘，如時間過短，不能得到“老化”的凝膠與玻片粘合不緊，容易在液體浸泡處理和電泳過程中自然脫落，造成實驗失敗；反之，如果放置時間過長，凝膠極易干裂而脫落。

第2層凝膠是1%低凝點（26±2）℃瓊脂糖液，與細胞混合時瓊脂糖液的溫度30~37℃，溫度過高可引起細胞損傷，此操作過程力求快速，以免加速細胞DNA的修復。

2.細胞數和實驗溫度的影響：

（1）實驗細胞數應調至約3.0×105，如果細胞數過低，一張片子中細胞數太少，很難完成100個彗星計數分析；反之細胞數過高，片中細胞過密，位于不同層面的細胞相互重疊，難以分析彗星DNA損傷。

（2）實驗溫度的控制。樣品應置4℃環境下進行，以抑制或降低核酸內切酶等活性，阻止DNA損傷的修復，從而達到準確地檢測DNA初級損傷。已有研究表明一些細胞DNA斷裂損傷能在1小時內達到90%的修復，3小時達到97%，因此，應嚴格控制細胞在分析過程中的溫度。

3.堿化處理及電泳的條件：

凝膠內的細胞需在堿性（pH值10）環境下進行處理，其作用一是去除細胞蛋白質，使DNA暴露出來；其次是堿化處理使DNA緊密螺旋結構解旋，DNA損傷片斷及其極性端暴露出來。

電泳條件：電壓或電流過大，嚴重受損傷的細胞可能出現的拖尾過長，彗星消失而影響結果，其次是正常的細胞可能因電壓或電流過大而形成少許拖尾的假陽性結果。

反之，電壓或電流過小，受損傷的細胞不會出現拖尾，而出現假陰性結果。電泳的電壓多選用低電壓，一般在18~50v，在電泳過程中電泳液的溫度應不超過15℃（應在4℃條件下進行），電泳時間多在20~40分鐘。

4.熒光染色及彗星圖象分析：

（1）采用DAPI熒光劑染色，質量濃度在1~5μg/ml，用量為10μl。染色15分鐘后即可觀察，視野中明亮熒光的“彗星”被光照時間一般不易超過2分鐘，以免熒光劑快速衰退而不宜繼續觀察和拍照。

（2）彗星的圖像分析主要靠肉眼顯微鏡讀片，對DNA損傷程度標準的正確判斷是非常重要的。不同程度損傷可根據彗星的尾部與其頭部的比率大小分為0、1、2、3、4五個等級。

0級無拖尾表明無損傷，當DNA損傷程度由輕到重，則彗星的尾部逐漸變長變大，頭部逐漸變小熒光強度逐漸變弱。用肉眼觀察判斷的分級需要通過計算機彗星圖象分析加以確定，目前已有彗星電腦分析軟件可供使用，如Komet3.0等。

總之，嚴格控制SCGE的各種影響因素，使其真正成為一種可靠、易于掌握和有效的DNA斷裂損傷和修復檢測的新技術。