單細胞RNA測序，眾多研究都pick它

　　多細胞測序和單細胞測序，你pick誰？如今，大多數研究人員也許會選擇后者，因為不一樣的角度，會帶來不一樣的見解。

　　多細胞測序和單細胞測序，你pick誰？如今，大多數研究人員也許會選擇后者，因為不一樣的角度，會帶來不一樣的見解。單細胞測序的最初動力來自癌癥研究，可幫助人們了解腫瘤異質性和腫瘤微環境。它還有助于我們了解其他的復雜生物系統，比如中樞神經系統和免疫系統。

　　如今，單細胞分選工具和建庫技術的成熟，以及新一代測序技術的普及，讓人們能夠高通量地開展單細胞RNA測序（scRNA-seq）。考慮到單細胞實驗通常缺乏空間關系，新的方法和算法也將單細胞基因表達的測定與組織內的空間定位結合起來。

　　優點與缺點

　　當然，正如每個硬幣都有兩面，單細胞RNA測序也有優點和缺點。它的主要優勢之一在于能夠發現未知的東西。不過，這種神奇視角也伴隨著一些缺陷，比如缺乏靈敏度。

　　在使用傳統的RNA測序時，研究人員通常會采用大塊的樣本，由多個細胞組成。因此，RNA-seq的靈敏度比scRNA-seq更高。加州大學圣地亞哥分校的Miles Wilkinson教授指出，將RNA-seq應用于大量細胞樣本時，科學家可以檢測到極低水平的基因表達，以及與化療或敲除相對應的基因表達變化。

　　“相反，單細胞RNA-seq往往只能識別基因組中一小部分表達的基因，”他補充說。“它通常無法檢測到基因表達中的細微變化。為了達到統計顯著性，至少需要兩倍或三倍的變化。”

　　這并不是scRNA-seq的唯一挑戰。Fluidigm的RNA-seq產品管理總監Steve Kain介紹，其他需要考慮的因素包括成本和復雜性。“人們必須檢測大量單細胞，才能獲得統計學上有意義的結果，”他說。“通常，這會增加文庫制備和測序的成本。不過微流體方法可將此類成本降至最低。”

　　盡管存在一些缺點，但scRNA-seq絕對是值得期待的。想象一下，用藥物處理組織后，對大量細胞進行分析，發現某種RNA增加了100倍。“你其實并不清楚究竟是組織中的每個細胞以相同方式應答，還是少數細胞中的RNA增加了1,000倍，”Kain解釋說。scRNA-seq帶來了一個機會，讓您能夠更深入地了解哪些細胞產生了應答。它能揭示組織或器官中每種細胞的轉錄狀態，而不是提供所謂的“平均值”。

　　樣本制備

　　首先，你需要從樣本中獲得單個細胞。盡管某些樣本可以采用熒光激活細胞分選（FACS）技術，但有些組織卻面臨著更大的挑戰。Invent Biotechnologies公司的首席技術官Q. Lee表示：“人們很難在不損傷細胞的前提下，從大腦、脂肪和心臟等組織中分離出單個細胞。”

　　“另外一個問題是，大多數的臨床樣本都是冷凍的，很難從冷凍組織中分離出完整的細胞，”Lee說。目前，Invent Biotechnologies開發出幾款試劑盒，能夠更輕松地從冷凍組織中分離出細胞核，比如說適用于新鮮/冷凍組織的Minute? Cell Suspension Isolation Kit。

　　研究人員不僅可使用單細胞，也可以使用單細胞核。之前的研究證明，核轉錄組和全細胞轉錄組在細胞類型標志物的表達上具有高度的一致性。Invent Biotechnologies也提供了幾種試劑盒，能夠很方便地從各種新鮮/冷凍組織中分離細胞核，包括脂肪組織、神經組織/細胞以及普通組織/細胞。

　　研究人員也可以考慮其他方法，比如Fluidigm的微流體技術。它家的C1單細胞mRNA測序流程能夠自動處理數百個單細胞，輕松鑒定組織中的細胞組成，并比較樣本中特定細胞的豐度。據Kain介紹，C1還支持單細胞的多組學分析，這使得人們能夠從每個細胞中獲得更多信息。

　　同時，他們也可以采用不同的方法收集所需的細胞。“激光捕獲顯微切割技術的進步可以大大提高scRNA-seq的效率和質量，”Kain談道。“Fluidigm AccuLift激光捕獲顯微切割系統之類的新技術確保了極其精確的靶向，既可以實現溫和的單細胞捕獲，又可以有效地切割較大的組織區域，同時保留生物分子的完整性。”

　　一些平臺還能夠實現高通量。例如，Wilkinson教授舉例說，10x Genomics的技術可處理更多的細胞，并且是一臺相當簡單的機器。10x Genomics的Chromium Controller是基于微流控技術的單細胞文庫制備系統，能夠高效地生成100-80,000個單細胞，制備出的文庫和Illumina平臺兼容。

　　發育和疾病

　　單細胞中的RNA變化讓科學家和醫生能夠更深入地了解疾病。麥吉爾大學的神經外科醫生Kevin Petrecca表示：“我們利用scRNA-seq來鑒定膠質母細胞瘤和正常大腦中各類細胞的轉錄組。”他認為，單細胞圖譜分析的優勢在于，它能夠全面地了解腫瘤內存在的不同類型癌細胞，以及這些癌細胞與正常細胞的相似程度。

　　例如，Petrecca及其同事采用scRNA-seq來分析53,586個膠質母細胞瘤細胞和22,637個正常腦細胞。他們報告稱：“這項分析表明，正常大腦發育與膠質母細胞瘤的發育一致，這暗示了腫瘤層次結構的可能來源，并有助于確定癌癥干細胞特異性的靶點。”這類信息對侵襲性癌癥特別有用1。

　　這張圖片顯示了一名患者的癌細胞分化過程，祖細胞（黑色）發育成少突膠質細胞（紫色）、星形膠質細胞（紅色）和間充質細胞（綠色）。這些數據證明了癌癥層次結構中譜系分化的連續性。圖片來源：Kevin Petrecca。

　　上游和下游

　　許多單細胞分析的材料都是無比珍貴的臨床樣本。珍惜臨床樣本，要從樣本處理開始。如果你對此過程不熟悉，歡迎索取10x Genomics的《單細胞基因表達樣本制備指南》>> ，了解如何解離細胞以及如何清洗和過濾細胞。在槍頭選擇上，它也提供了一些建議。

　　一旦你收集了所需的細胞并對它們進行測序，下游就必須對數據進行分析。Wilkinson 表示：“對于生物信息學經驗豐富的實驗室而言，當前的分析流程非常友好。不過若實驗室沒什么數據分析經驗，我建議與別人合作。”

　　總而言之，單細胞RNA測序提供了其他方法無法獲得的許多信息。不過，這種方法也存在挑戰，包括解離細胞的挑戰以及數據分析的挑戰。如果無法分離出健康的單細胞，則可以用單細胞核來代替單細胞。市場上的許多新產品也許能大大減輕你的負擔。