單鏈Oligo合成與DNA組裝技術（二）

2.2 Golden Gate組裝

Golden Gate組裝技術是基于非同源重組的代表性技術，其利用Ⅱ型限制性酶 BsaⅠ在識別位點外部切割的特性，設計特異的突出序列同時組裝多個片段，且酶切和酶連可以同時進行，原理如圖3所示。首先，擴增目的片段，在兩端加上BsaⅠ識別序列，同時在識別序列內側加上不同的4 nt突出部分，相鄰片段衎接處的4 nt反向互補配對，然后將片段分別插入酶切前的中間載體，因此一共可以設計256個突出的末端。利用E.coli富集含有不同目的片段的中間載體，將這些載體與最終的載體(含有2個相鄰的BsaⅠ酶切位點)混合，加入BsaⅠ和DNA連接酶，同時進行酶切和酶連組裝多達9個DNA片段。

2011年，Cermak等人利用Golden Gate高效組裝了TALEN敲除系統中的重復序列，整個過程只需要兩步：第一步先將最多10個RVDs按順序組裝，每個RVDs可識別1個核苷酸；第二步再將這些RVDs和TALEN系統的其它功能元件如NLS、AD等組裝成最終的敲除質粒。2015年，Lauressergues等人使用Golden Gate構建microRNAs表達質粒，探究了苜蓿、擬南芥中2條 microRNAs的轉錄調控作用及其它5條microRNAs編碼的具有調控作用的短肽對植物主根生長的影響。

圖3 基于Bsa I內切酶的Golden Gate組裝

圖3 Golden Gate組裝

2.3 同尾酶BioBrick、iBrick 和 C-Brick

BioBrick是合成生物學領域一個經典的基因組裝技術，BioBrick的原理如圖4所示。同尾酶可以識別不同的DNA序列但是能切出相同黏性末端的一類限制性內切酶，但其切開的末端相互連接后不會再形成原酶切位點。其利用同尾酶Xba Ⅰ和 Spe Ⅰ酶切產生相同的粘性末端，酶連后片段連接處會產生86p的疤痕，Xba Ⅰ和Spe Ⅰ都不再識別連接處的疤痕，這樣即可在不損失酶切位點的情況下不斷組裝DNA片段。2014年，國內學者利用歸位內切酶I-Sce Ⅰ和PI-Psp Ⅰ可產生相同粘性末端的特點，模仿BioBrick原理設計出一種名為iBrick的DNA 組裝方法。歸位內切酶識別的序列比普通的限制性內切酶長，在DNA中出現的頻 率極低，因此iBrick相比于BioBrick對DNA片段序列幾乎沒有限制。但較長的識別序列在酶切酶連組裝的同時也產生了更長的疤痕，為了解決這個問題，科學家利用一種應用了CRISPR-Cas系統的DNA組裝方法C-Brick。C-Brick利用Ⅴ型CRISPR/Cas 系統蛋白Cpf1核酸內切酶，在PAM位點切割產生5nt的粘性末端。該方法利用sgRNA識別長序列的特點避免了對待組裝片段序列的要求，同時可靈活設計sgRNA以識別不同的序列，只產生5 bp的疤痕，完美地規避了 BioBrick 的缺點。

圖4 BioBrick技術的組裝原理

2.4 基于DNA聚合酶的策略。

該方法首先合成有互補配對重疊區的Oligo，利用PCR擴增的原理，可以對有互補重疊區的Oligo進行延伸連接獲得小DNA片段，然后小DNA片段以重疊PCR的方式進行逐步連接獲得目的DNA片段，以其作為模板，進一步PCR擴增可以大量獲得目的片段（圖5）。此方法（polymerase cycling assembly，PCA）無須依賴額外的DNA連接酶，直接從人工合成的Oligo開始組裝，操作簡單、快速。Stemmer 等人曾用此法實現基因及質粒的一步拼裝。Smith等人則 通過增加 Taq 連接酶的步驟用此法合成了 ФX174 噬菌體 的基因組。

圖5 基于DNA聚合酶合成法

3.  其他DNA組裝技術