附 加 材 料（其他材料見基本方案 2) 候 選 雜 交 瘤 系（見輔助方案 2) 克隆和擴增用培養基（見輔助方案 4) 微 孔 板 觀 察 鏡（由 Flow 實驗室或 Dynatech 公司提供），可選的 1.重懸候選雜交瘤所在孔中的細胞（見 輔 助 方 案 2 , 步 驟 4)，用血細胞計數器和臺盼藍 拒 染 試 驗（附 錄 3C) 對 一 部 分（50|ul) 細胞進行計數和細胞活力測試。 2.以每毫升 5 0 個活細胞和每毫升 5 個活細胞的量分別準備 IOml 含有克隆和擴增用養 基 的 細 胞 懸 液（根據需要多次稀釋）。將 細 胞 懸 液 移 種 至 9 6 孔 板 ，每 個 孔 200ul(最終每孔分別為 1 0 個細胞和 1 個細胞）。 CO2 培養箱中培養 7?10d。 3.觀察出現雜交瘤生長的孔數，以確定哪一種稀釋度對于單克隆的生長是最佳的。把孔板舉高肉眼觀察或使用微孔板觀察鏡對雜交瘤進行觀察。 4.在繼續細胞培養之前，用倒置顯微鏡觀察單克隆細胞。單一的致密細胞集落是單克隆細胞增殖的典型特征，而多克隆細胞增殖往往出現多個細胞集落，盡可能不要使用多克隆細胞生長的孔。 5.應用與篩選主要孔細胞（見輔助方案1 ) 相同的方法檢測培養 7?14d 的單克隆細胞分泌目標抗體的活性（對于小鼠-小鼠雜交瘤應于第 7 天 ；所有的孔都應該在其顏色變黃時進行檢測）。使用部分原雜交瘤的培養上清（見 輔 助 方 案 2 , 步 驟 6 ) 作為陽性對照。 6.如果已經確定得到了所需的細胞克隆，按與原雜交瘤相同的方法（見輔助方案2 ) 擴增并凍存這個細胞克隆。 7.按 步 驟 1 和 2 再次克隆陽性雜交瘤克隆，配 制 含 有 6 0 個 活 細 胞 的 40m l 克隆用培養基（最 終 為 0.3 個細胞/孔），重復步驟 4?6。 8.連 續 3 天 ，每天以 1 : 2 的比例將再次克隆的細胞轉入 DMEM-10完全/HEPES/丙酮酸鈉培養液，以使所需的雜交瘤成為穩定的細胞系。一株偶然克隆的雜交瘤會無法適應 DMEM-10完全/ HEPES / 丙酮酸鈉培養液的環境，并要求較高濃度的 FCS。 因此，在 轉 入 DMEM-10培養基之前先將細胞轉入 DMEM-1 5 培養基。在此過程中應謹防支原體污染（附 錄 3F)。 9.在不同天數凍存多個裝有細胞的小瓶（含各不相同量的凍存用培養基，見 附 錄 3B)。復蘇樣品瓶，以適當方法檢測細胞生長活性和培養上清中單克隆抗體（MAb) 的活性 。應用雜交瘤大規模制備腹水和培養上清（單 元 1.4)。檢 測 M A b 的 同 種 型（單元 1. 1) 即使是再次克隆的雜交瘤也會具有不穩定性，尤其是某些倉鼠-小鼠雜交瘤。這樣的雜交瘤需要繼續進行克隆。長時間的體外培養可能導致 M Ab 的不分泌。為了減少這一問題帶來的影響，將部分已知可以生產 M Ab 的細胞凍存起來是必要的，同時這些細胞將來也可以作為活性細胞的來源。 展開 | 