厭氧菌培養方法、結核桿菌生長現象觀察、抗酸染色

厭氧菌是自然界中分布廣泛、性能獨特的一類微生物, 專性厭氧菌因其細胞內缺乏超氧化物歧化酶、過氧化氫酶或過氧化物酶,因此無法消除機體在有氧條件下產生的有毒產物——超氧陰離子自由基，故這類微生物極易受氧毒害。專性厭氧微生物即使短暫地把它暴露于空氣中,也會引起損傷致死。因此對它們進行分離、培養和研究時,就必須有一套相應的培養分離方法。
目的要求
1、了解厭氧菌培養常用方法：皰肉培養法、焦性沒食子酸法、厭氧罐法、厭氧箱法、厭氧培養袋法等。
2、掌握結核桿菌的形態特點，熟悉結核桿菌的培養特性。
3、掌握抗酸染色的原理及操作過程。
4、了解結核桿菌標本的采集、培養前處理及制片。
材料
皰肉培養基、厭氧罐、厭氧箱、厭氧培養袋、焦性沒食子酸、NaOH、脫脂棉等
內容與方法
厭氧菌培養方法：包括物理、化學和生物學方法（總之為厭氧菌培養形成一種無氧環境）
1. 厭氧罐法：
厭氧產氣袋加入水后會產生氫氣和二氧化碳，氫氣在厭氧催化劑（冷觸酶鈀粒鈀粒由粉紅色變成淺蘭色而失效，160℃2h，即可恢復其活力而重復使用）的作用下，與氧結合生成水，可在30分鐘內將氧含量降至1%以下。二氧化碳可以促進厭氧菌的生長。罐內放有煮沸去氧的美蘭指示劑一管。 [每次要新鮮配制，在試管內將亞甲藍(0.5%亞甲藍3ml加水至100 ml)、6%葡萄糖和氫氧化鈉(1/10 mol/L NaOH 6 ml加水至100 ml)3種溶液等量混合并煮沸還原至無色，立即將指示劑管放入預先裝好培養物的罐內。如果能在孵育的整個過程中維持厭氧條件，則指示劑溶液將無色，否則指示劑則變色。亞甲藍有氧為藍色，無氧為無色。] 亞甲藍作為一種氧化還原指示劑。
2.焦性沒食子酸法：
焦性沒食子酸+NaOH→焦性沒食子橙（黑、褐色）[吸收游離的氧氣]。
培養皿法用培養皿蓋，鋪上一薄層滅菌脫脂棉，將1g焦性沒食子酸放于其上。用肉膏蛋白陳瓊脂培養基倒平板，待凝固稍干燥后，在平板上一半劃線接種巴氏芽孢梭菌，下一半劃線接種熒光假單胞菌，并在皿底用記號筆作好標記。滴加10％NaOH溶液約0.5ml于焦性沒食子酸上，切勿使溶液溢出棉花，立即將已接種的平板覆蓋于玻璃板上或培養皿蓋上，必須將脫脂棉全部罩住，焦性沒食子酸反應物切勿與培養基表面接觸，以溶化的石蠟密封皿底與玻璃板或皿蓋的接觸處。置37℃溫箱培養24～48h。
3.厭氧培養箱法：
由厭氧環境操作箱、恒溫培養箱、高度真空傳遞箱等組成，能任意輸入所需氣體，準確調節流量，以滿足厭氧菌生長需要。
4.生物學方法
分枝桿菌生物學特性觀察
材料
結核分枝桿菌的培養物
方法
觀察結核分枝桿菌在改良羅氏培養基（含蛋黃、甘油、馬鈴薯和天門冬酰胺等）上的菌落特點：呈干燥顆粒狀，乳白色或米黃色，形似花菜心。結核桿菌12～24h繁殖一代，3～4W形成菌落。
抗酸染色法
原理
分枝桿菌細胞壁含脂質較多,其中主要成分為分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色時與石炭酸復紅結合牢固,能抵抗酸性乙醇的脫色作用,因此抗酸菌能保持復紅的顏色,達到染色目的。
材料
酒精燈、玻片、結核病人痰液、石碳酸復紅、鹽酸酒精、堿性美蘭等
步驟
1.取開放性肺結核病人的痰液涂片，自然干燥后，通過火焰固定。
2.初染：痰膜上加一小的方形吸水紙，在吸水紙上滴加石炭酸復紅染液，在火焰高處徐徐加溫至冒蒸氣，并維持 5 分鐘（注意切勿讓染液沸騰或煮干），當染液蒸發減少時，需再加染液補充。待標本片冷卻后水洗。
3.用 3% 鹽酸酒精脫色，至無紅色染液流下為止（反復2～3次，一般需要1～2min）水洗。
4.復染：用堿性美藍復染 1 分鐘，水洗，吸干，鏡檢。抗酸桿菌呈紅色，背景及非抗酸菌呈藍色。