（2） 膠原酶（Collagenase）消化法
膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細胞間質有較好的消化作用，對細胞本身影響不大，可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養液配制，即操作簡便又可提高細胞成活率，最終濃度200u/mL或0.1~0.3mg/mL.此酶消化作用緩和，無需機械振蕩，但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗成本。
經過膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細胞對酶有耐受性，可能有一些上皮細胞團塊尚未被完全消化開。成小團塊的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此不必要再進一步消化處理。
鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學活性（見表4-1）和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時間（小時）有差異（見表4-2），以及兩者價格不等，有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用，同時還可加透明質酸酶（對細胞表面糖基有作用），采用兩者的聯合消化作用，對分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效。
表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別
| 項 目 | 胰蛋白酶 | 膠原酶 |
| 消化特性 | 適用于消化軟組織 | 適用于消化纖維多的組織 |
| 用 量 | 0.01%~0.5% | 0.1~0.3mg/mL（200u/mL） |
| 消化時間 | 0.5~2小時（小塊） | 1~12小時 |
| pH | 8~9 | 6.5~7.0 |
| 作用強度 | 強烈 | 緩和 |
| 細胞影響 | 時間過長有影響 | 無大影響 |
| 血清、鈣、鎂離子 | 有影響 | 無影響 |
表4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時所需時間（小時）（0.5~1cm3）
| 酶 種 類 | 較 硬 組 織 | 軟 組 織 | ||||
| 4℃ 室 溫 37℃ | 4℃ 室 溫 37℃ | |||||
| 胰蛋白酶（0.25%） | 24~48 | 1~6 | 1~2 | 12~24 | 1~2 | 0.5~1 |
| 膠原酶（200u/mL） | 24 | 6 | 6.5 | 12 | 3 | 0.25 |
| 兩者聯合（對沖） | 12~46 | 12~24 | 4~12 | 12~24 | 6~12 | 1~2 |
除上述兩種最常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年來，還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細胞更佳。
2、非酶消化法（EDTA消化法）
EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑或Versene,全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學物質能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物，利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離，缺點是細胞易裂解或貼壁細胞從瓶壁上脫離時呈片狀，有團塊，常不單獨使用，但可與胰蛋白酶混合使用（1:1或2:1），不僅利于細胞脫壁又利于細胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。
消化分離法的操作步驟：
（1）剪切 把組織塊剪碎，呈1~5mm3大小的組織塊。
（2） 加液漂洗 將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無鈣鎂PBS洗2-3次（采用傾斜，自然沉降法）。
（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當時間（中間可輕搖1~2次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時間不宜過長。
（4）棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。
（5）漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培養基。
（6）機械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使細胞充分散開后用紗網或3~4層無菌紗布過濾后分瓶培養，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘，吸上層細胞懸液進行分瓶培養。
注意事項如下：
（1）組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。
（2）胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。
（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產生，而且動作要輕，以避免膨松的細胞隨漂洗而丟失。