原代細胞培養和傳代培養的方法

　　原代培養

　　原理

　　將動物機體的各種組織從機體中取出，經各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用 EDTA 或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖這一過程稱原代培養。

　　儀器、材料及試劑

　　儀器：培養箱（調整至 37℃），培養瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術器械、血球計數板、離心機、水浴箱（37℃）

　　材料：動物組織塊

　　試劑：1640 培養基（含 20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒

　　初代消化培養法

　　1.準備：取各種已消毒的培養用品置于凈化臺面，紫外線消毒 20 分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

　　2.布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。

　　3.處理組織：把組織塊置于燒杯中，用 Hanks 液漂洗 2~3 次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中 30~60 分鐘。

　　4.剪切：用眼科剪把組織切成 2~3 毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多

　　30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞。

　　5.消化：或用恒溫水浴，或置于 37℃溫箱消化均可，消化中每隔 20 分鐘應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。

　　6.分離：在消化過程中見消化液發混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織

　　已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（500~1000 轉/分）離心消化液 5 分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養液。

　　7.計數：用計數板計數，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養液調整后，分裝入培養瓶中。對大多數細胞來說，pH 要求在 7.2~7.4 范圍，培養液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3 調整。

　　8.培養：置于 36.5℃溫箱培養，如用 CO2 溫箱培養，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。

　　初代組織塊培養法

　　1.剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用 Hanks 液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜 Hanks 液，用眼科剪反復剪切 1mm3 塊為止。

　　2.擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養瓶底部，小塊相互距離以 0.5cm 為宜，每一 25ml 培養瓶底可擺布 20~30 塊。

　　3.輕輕翻轉培養瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿另組織小塊流動，塞好瓶塞，置 36.5℃ 溫箱培養 2 小時左右（勿超過 4 小時），使小塊微干涸。

　　4.培養：從微箱中取出培養瓶，開塞，46 度斜持培養瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養液少許，然后緩緩再把培養瓶翻轉過來，讓培養液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養。待細胞從組織塊游出數量增多后。再補加培養液。

　　傳代培養法

　　原理

　　細胞在培養瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續生長，同時

　　也將細胞數量擴大，就必須進行傳代（再培養）。 傳代培養也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以， 而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。

　　材料和試劑

　　1. 細胞：貼壁細胞株

　　2. 試劑：0.25％胰酶、1640 培養基（含 10％小牛血清）

　　3. 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養箱、培養瓶、吸管、廢液缸等操作步驟

　　1.吸除培養瓶內舊培養液。

　　2.向瓶內加入胰蛋白酶和EDTA 混合液少許，以能覆滿瓶底為限。

　　3.置溫箱中 2~5 分鐘，當發現細胞質回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化。

　　4.吸除消化液，向瓶內注入 Hanks 液數毫升，輕輕轉動培養瓶，把殘余消化液沖掉。注意加 Hanks 液沖洗細胞時，動作要輕，以免把已松動的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用 Hanks 液沖洗，直接加入培養液。

　　5.用吸管吸取營養液輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。

　　6.計數板計數后，把細胞懸液分成等份分裝入數個培養瓶中，置溫箱中培養。

　　無菌操作注意事項

　　1.操作前要洗手，進入超凈臺后手要用 75%酒精或 0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。

　　2.點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。

　　3.操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。

　　4.不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。

　　5.瓶子開口后要盡量保持 45℃斜位。

　　6.吸溶液的吸管等不能混用。