原位免疫PCR的IHC增敏方法原理和操作流程

（一）基本原理

Sano等（1992）率先利用基因工程的方法表達了A蛋白與鏈霉親和素的嵌合體分子獲得成功，建立了免疫PCR技術。這是一種新的抗原檢測系統，利用細胞工程和基因工程技術，巧妙地將抗原抗體反應的特異性同PCR的敏感性相結合，通過構建單克隆抗體與重組核酸的嵌合體分子，使得利用PCR技術檢測蛋白成為可能。隨后在免疫PCR的基礎上，建立了在細胞或組織原位檢測抗原的原位免疫PCR（in situ immuno-PCR）。

原位免疫PCR是一種檢測系統，需要一種中介分子同時具有與DNA和抗體分子特異性結合的能力，其一端連接DNA,另一端連接抗原-抗體復合物，形成一個抗原-抗體-DNA連接物。作為標記的DNA分子用PCR擴增，檢測特異的PCR產物，即可間接證明抗原的存在。該技術與原位PCR不同，就是在 PCR與原位雜交之間加了抗體的因素。原位PCR是先對切片或涂片進行PCR,以對組織細胞內的DNA或RNA進行擴增，使其拷貝數大大增加，然后再進行原位分子雜交。而該技術是先用特異性抗體（單抗）與相應或目的抗原反應。這個抗體在對抗原反應之前加上了人體不存在的或無關的DNA序列。抗體與抗原特異性反應后，用PCR擴增加在抗體上的DNA序列，然后再用該DNA序列的探針進行雜交檢測，也就是說用PCR及雜交的方法來放大免疫組織化學的反應，檢測目標是蛋白質。

（二）操作流程

（1）4um石蠟切片常規脫蠟至水。

（2）0.3%H2O2處理20min；PBS洗3min×3。

（3）抗原修復，或3mol/L酶消化；PBS洗3min×3。

（4）加入特異性一抗，37℃，1h；PBS洗3min× 3。

（5）加人生物素化二抗（1:400），37℃，1h；PBS洗3min× 3。

（6）加入鏈霉親和素（1:100），37℃，1h；PBS洗3min× 3。

（7）加人生物素化pUCl9 DNA；20ng/片37℃，1h；PBS洗3min× 3。

（8）PBS洗，進行原位PCR反應（在原位PCR儀上進行）。50×反應液中含25umol/L引物1ul，2mmol/L dUTPs（1mmol/L dTTP和生物素-dUTP、20mmol/L dATP和dCTP）各lul，10X緩沖液5ul，Taq酶2U。原位PCR程序為：94℃，40s；55℃，40s；72℃，20s；循環30次，最后72℃延伸5min；PBS洗3min×3。

（9）加入鏈霉親和素-HRP（1;200），37℃，30rain;PBS洗3min×3.

（10）DAB+H202顯色。

（11）常規蘇木精襯染和封片。

（三）應注意的問題

（1）防止非特異性染色。所用的外源性DNA片段和引物必須和人體內基因或被檢靶細胞中無互補系列，防止非特異性結合，出現假陽性。

（2）采用尿素或微波抗原修復方法替代酶消化切片，避免微量殘存蛋白酶對Taq酶的降解，影響PCR擴增的效率，使敏感性下降。

（3）防止脫片，充分洗滌，防止非特異性結合和擴散。

（4）必須設計各種陽性和陰性對照。

以上方法主要是增加免疫組化敏感性的方法，當然再敏感也應保持特異性，不然提高敏感性就毫無意義，敏感性是在保留特異性的基礎上發展起來的。