原位雜交法測定TNF的mRNA

實驗概要

本實驗用原位雜交法測定了TNF的mRNA。

主要試劑

1. 原位雜交

   1) TNF-DNA探針

   2) 地高辛標記液試劑盒

   3) 雜交液：60%去離子甲酰胺，300mmol/L NaCl、30mmol/L檸檬酸鈉、10mmol/L EDTA 25mmol/L NaH₂PO₄(pH7.4)，5%葡聚糖硫酸酯，250μg/μl變性鮭精DNA

2. 洗滌

   1) 2×SSC：1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C₆H₅O₇NA₃·2H₂O，分子量294)8.8g

   2) 0.5×SSC：300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可

   3) 0.2×SSC：270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可

3. 熒光抗體檢測

   1) 封閉液：Tris-HCl 100mmol/L PH7.5，NaCl 150mmol/L，0.5%羊血清。

   2) 抗DIG-熒光素抗體

   3) 洗滌液：0.1M，pH7.2～7.4PBS。

   4) 20%甘油：20ml甘油加80ml蒸餾水即可。

   5) 乙醇：70% 90% 100%

   6) 防退色溶液：九份甘油與一份染液(1mmol/L Tris-HCl pH7.5，2% 1.4-diaza-bicyclo[2，2，2]-Octane，500ng/ml propidiumiodide)

   7) 地高辛標記和檢測試劑盒

主要設備

1. 原位雜交

溫箱，水浴鍋，加樣器，吸頭，染色缸等

2. 熒光抗體檢測

加樣器，吸頭，染色缸等

實驗步驟

1. 原位雜交

   1) 用地高辛標記DNA探針；

   2) 準備雜交液；

   3) 臨用前，將DIG標記的DNA探針在80℃加熱10分鐘，迅速置冰浴中變性后，將其加入雜交液中，至終濃度5μg/μl；

   4) 將10-20μl雜交混合液(雜交液加變性探針)加入到固定并增加了通透性的細胞上，蓋上專用原位雜交蓋玻片，放入盛有約20ml 20%甘油濕盒內37℃使其雜交過液。

2. 洗滌

揭掉蓋玻片，30-37℃左右水溫的2×SSC洗滌5min×2次，0.5×SSC洗滌15min×1次，0.2×SSC洗滌15min×1次。

3. 熒光抗體檢測

   1) 每塊載玻中上加100μl封閉液，封閉非特異性結合位點；

   2) 用封閉液將抗DIG-熒光素抗體按1：500稀釋加在載玻片上，置濕盒內37℃溫育45min，用洗滌液洗5min×4次；

   3) 用100mol/L Tris-HCl(pH7.5)，150mmol/L NaCl，0.05% Tween 20洗載玻片；

   4) 將細胞樣品依次在70%，90%，100%乙醇浸泡5分鐘，脫水；

   5) 將玻片在空氣中干燥；

   6) 將細胞樣品放在防退色溶液中，取出封片。