原核表達載體的重要調控元件（啟動子、SD序列與終止子）

1．啟動子

啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結合并起始RNA合成的序列，它是基因表達不可缺少的重要調控序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。由于細菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子，因此原核表達載體所用的啟動子必須是原核啟動子。

原核啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成，對mRNA的合成極為重要。在轉錄起始點上游5～10 bp處，有一段由6～8個堿基組成，富含A和T的區域，稱為Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10區。來源不同的啟動子，Pribnow 盒的堿基順序稍有變化。在距轉錄起始位點上游35 bp處，有一段由10 bp組成的區域，稱為-35區。轉錄時大腸桿菌RNA聚合酶識別并結合啟動子。-35區與RNA聚合酶s亞基結合，-10區與RNA聚合酶的核心酶結合，在轉錄起始位點附近DNA被解旋形成單鏈，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯鍵，以后在RNA聚合酶作用下向前推進，形成新生的RNA鏈。

原核表達系統中通常使用的可調控的啟動子有Lac(乳糖啟動子)、Trp(色氨酸啟動子)、Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動子) 、lPL (l噬菌體的左向啟動子)、T7噬菌體啟動子等。

（1）Lac啟動子：它來自大腸桿菌的乳糖操縱子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、啟動基因(P)、操縱基因(O)和編碼3個與乳糖利用有關的酶的基因結構所組成。Lac啟動子受分解代謝系統的正調控和阻遏物的負調控。正調控通過CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP來激活啟動子，促使轉錄進行。負調控則是由調節基因產生LacZ阻遏蛋白，該阻遏蛋白能與操縱基因結合阻止轉錄。乳糖及某些類似物如IPTG可與阻遏蛋白形成復合物，使其構型改變，不能與O基因結合，從而解除這種阻遏，誘導轉錄發生。

（2）trp啟動子：它來自大腸桿菌的色氨酸操縱子，其阻遏蛋白必須與色氨酸結合才有活性。當缺乏色氨酸時，該啟動子開始轉錄。當色氨酸較豐富時，則停止轉錄。b-吲哚丙烯酸可競爭性抑制色氨酸與阻遏蛋白的結合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp啟動子轉錄。

（3）Tac啟動子：Tac啟動子是一組由Lac和trp啟動子人工構建的雜合啟動子，受Lac阻遏蛋白的負調節，它的啟動能力比Lac和trp都強。其中Tac 1是由Trp啟動子的－35區加上一個合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操縱基因構成，Tac 12是由Trp的啟動子-35區和Lac啟動子的-10區，加上Lac操縱子中的操縱基因部分和SD序列融合而成。Tac啟動子受IPTG的誘導。

（4）lPL啟動子：它來自l噬菌體早期左向轉錄啟動子，是一種活性比Trp啟動子高11倍左右的強啟動子。lPL啟動子受控于溫度敏感的阻遏物 cIts857。在低溫(30℃)時，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL啟動子轉錄。在高溫(45℃)時，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL啟動子轉錄。系統由于受cIts857作用，尤其適合于表達對大腸桿菌有毒的基因產物，缺點是溫度轉換不僅可誘導PL啟動子，也可誘導熱休克基因，其中有一些熱休克基因編碼蛋白酶。如果用l噬菌體cI+溶源菌，并用絲裂霉素C或萘啶酮酸進行誘導，可緩解這一矛盾。

（5）T7噬菌體啟動子：它是來自T7噬菌體的啟動子，具有高度的特異性，只有T7RNA聚合酶才能使其啟動，故可以使克隆化基因獨自得到表達。T7RNA聚合酶的效率比大腸桿菌 RNA聚合酶高5倍左右，它能使質粒沿模板連續轉錄幾周，許多外源終止子都不能有效地終止它的序列，因此它可轉錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉錄的序列。這個系統可以高效表達其他系統不能有效表達的基因。但要注意用這種啟動子時宿主中必須含有T7RNA聚合酶。應用T7噬菌體表達系統需要2個條件：第一是具有T7噬菌體RNA聚合酶，它可以由感染的l噬菌體或由插入大腸桿菌染色體上的一個基因拷貝產生；第二是在一個待表達基因上游帶有T7噬菌體啟動子的載體。

2．SD序列

1974年Shine和Dalgarno首先發現，在mRNA上有核糖體的結合位點，它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp處的由3～9 bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互補，是核糖體RNA的識別與結合位點。以后將此序列命名為Shine-Dalgarno序列，簡稱SD序列。它與起始密碼子AUG之間的距離是影響mRNA轉錄、翻譯成蛋白的重要因素之一，某些蛋白質與SD序列結合也會影響mRNA與核糖體的結合，從而影響蛋白質的翻譯。另外，真核基因的第二個密碼子必須緊接在ATG之后，才能產生一個完整的蛋白質。

3．終止子

在一個基因的3￠末端或是一個操縱子的3￠末端往往有特定的核苷酸序列，且具有終止轉錄功能，這一序列稱之為轉錄終止子，簡稱終止子 (terminator)。轉錄終止過程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進，RNA的延伸也停止在終止信號上，完成轉錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來。對RNA聚合酶起強終止作用的終止子在結構上有一些共同的特點，即有一段富含A/T的區域和一段富含G/C的區域，G/C富含區域又具有回文對稱結構。這段終止子轉錄后形成的RNA具有莖環結構，并且有與A/T富含區對應的一串U。轉錄終止的機制較為復雜，并且結論尚不統一。但在構建表達載體時，為了穩定載體系統，防止克隆的外源基因表達干擾載體的穩定性，一般都在多克隆位點的下游插入一段很強的rrB核糖體RNA的轉錄終止子。