原理易懂然而難做，qPCR結果分析的常見問題

　　qPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即實時熒光定量核酸擴增檢測系統，也叫實時定量基因擴增熒光檢測系。qPCR主要是利用插入性染料或熒光探針（比如TaqMan），人們可以通過監控PCR過程中的熒光強度比較多個樣品的DNA水平。數字PCR（dPCR）的基本工作原理很簡單，先將樣品劃分為多個PCR反應，每個反應最多只含有一個模板。然后通過計數正負反應來確定初始樣品中模板分子的數量。

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　　qPCR分析的常見問題

　　1. 無Ct值出現

　　檢測熒光信號的步驟有誤: 一般SG法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。

　　引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測其完整性。

　　模板量不足: 對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

　　模板降解: 避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。

　　2. Ct值出現過晚（Ct>38）

　　擴增效率低: 反應條件不夠優化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。

　　PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。

　　PCR產物太長: 一般采用80-150bp的產物長度。

　　3. 標準曲線線性關系不佳

　　加樣存在誤差: 使得標準品不呈梯度。

　　標準品出現降解: 應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品。

　　引物或探針不佳: 重新設計更好的引物和探針。

　　模板中存在抑制物，或模板濃度過高

　　4. 負對照有信號

　　引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。

　　引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

　　鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。

　　模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。

　　5. 溶解曲線不止一個主峰

　　引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。

　　引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

　　鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。

　　模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。

　　6. 擴增效率低

　　反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

　　反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。

　　反應體系中有PCR反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。

　　7. 同一試劑在不同儀器上產生不同的曲線，如何判斷？

　　判斷標準：擴增效率，靈敏度，特異性

　　如果擴增效率在90%-110%，都是特異性擴增，都可以把數據用于分析。

　　8. 擴增曲線的異常？比如“S”型曲線？

　　參比染料設定不正確(MasterMix不加參比染料時，選NONE)

　　模板的濃度太高或者降解

　　熒光染料的降解