雙光子共聚焦顯微鏡

雙光子共聚焦顯微鏡是為了解決生物檢測中樣品染料標記的光漂白現象而提出的，因為共焦孔徑光闌必須足夠小以獲得高分辨率的圖像，而孔徑小又會擋掉很大部分從樣品發出的熒光，包括從焦平面發出的熒光，這樣就要求激發光必須足夠強以獲得足夠的信噪比；而高強度的激光會使熒光染料在連續掃描過程中迅速褪色（即光漂白現象），熒光信號會隨著掃描進程的進行變得越來越弱。除此之外，還有光毒作用問題，在激光照射下，許多熒光染料分子會產生諸如單態氧或自由基等細胞毒素，所以實驗中要限制掃描時間和激發光的光功率密度以保持樣品的活性。針對活性樣品的研究，尤其是活性樣品生長、發育過程的各個階段，光漂白和光毒現象將使這些研究受到很大的限制。

　　雙光子激發的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個較低能量（即更長的波長）的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個能量較高（即波長為長波長一半）的光子去激發熒光分子是相同的。雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達到 80 至 100 兆赫。在使用高數值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是最高的，雙光子激發只發生在物鏡的焦點上，所以雙光子共聚焦顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測效率。

　　雙光子共聚焦顯微鏡有很多優點：1）長波長的光比短波長的光受散射影響較小容易穿透標本；2）焦平面外的熒光分子不被激發使較多的激發光可以到達焦平面，使激發光可以穿透更深的標本；3）長波長的近紅外光比短波長的光對細胞毒性小；4）使用雙光子顯微鏡觀察標本的時候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，雙光子共聚焦顯微鏡比普通共聚焦顯微鏡更適合用來觀察厚標本、活細胞，或用來進行定點光漂白實驗