分離蛋白質組所有蛋白的兩個關鍵參數是其分辨率和可重復性。在目前情況下，雙向凝膠電泳的一塊膠板（16cm×20cm）可分出3～4千個，甚至1萬個可檢測的蛋白斑點，這與10萬個基因可表達的蛋白數目相比還是太少了。80年代開始采用固定化pH梯度膠，克服了載體兩性電解質陰極漂移等許多缺點而得以建立非常穩定的可以隨意精確設定的pH梯度。由于可以建立很窄的pH范圍（如0.05U/cm)，對特別感興趣的區域可在較窄的pH范圍內做第二輪分析，從而大大提高了分辨率。此種膠條已有商品生產，因此基本上解決了雙向凝膠電泳重復性的問題。這是雙向凝膠電泳技術上的一個非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有垂直板電泳和水平超薄膠電泳兩種做法，可分離10～100kD分子量的蛋白質。
其中靈敏度較高的銀染色法可檢測到4ng蛋白，最靈敏的還是用同位素標記，20ppm的標記蛋白就可通過其熒光或磷光的強度而測定。用圖像掃描儀、萊賽密度儀、電荷組合裝置可把用上述方法得到的蛋白圖譜數字化，再經過計算機處理，去除縱向和橫向的曳尾以及背景底色，就可以給出所有蛋白斑點的準確位置和強度，得到布滿蛋白斑點的圖像，即所謂“參考膠圖譜”。蛋白質組研究的主要困難是對用雙向凝膠電泳分離出來的蛋白，進行定性和定量的分析。最常用的方法是先把膠上的蛋白印跡到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再進行分析，確定它們是已知還是未知蛋白。現在的分級分析法是先做快速的氨基酸組成分析，也可先做4～5個循環的N末端微量測序，再做氨基酸組成分析；結合在電泳膠板上估計的等點電和分子量，查對數據庫中已知蛋白的數據，即可作出判斷。有文獻報道，N末端4個殘基序列的數據就可以給出很多的信息而得到相當準確的結果。如再結合C末端序列，判斷結果的準確性會更高。對分離得到的蛋白質作進一步的確切鑒定需要有足夠數量的純蛋白，電泳時蛋白質已經過了高度純化。現在一塊膠板可允許上到高達mg數量級的樣品，因此每個分離的蛋白斑點可有μg數量的蛋白，這樣使本來是微量的蛋白也可希冀被鑒定。