樣品要求
1、建議使用的蛋白質溶解體系為8M尿素/4%CHAPS /40mMTris（Base）/65mM DTT；
2、樣品濃度大于2 μg/ μl；
樣品制備
雙向電泳成功的關鍵在于建立一套有效的、可重復的樣品制備方法。樣品制備的影響因素包括蛋白質的溶解性、分子量、電荷數及等電點等。對于不同的樣品性質及研究目的，其方法也不盡相同。不同的樣品性質， 用于樣品處理的緩沖液必須在低離子強度的基礎上，既能保持蛋白質的天然電荷。又能維持其溶解性。因此，絕大多數樣品往往都需要通過多次實驗才能摸索到最適宜的條件。
第一向分離
等電聚焦
蛋白質是兩性分子，在不同的pH環境中可以帶正電荷、負電荷或不帶電荷。對每個蛋白質來說都有一個特定的pH，此時蛋白質的靜電荷為零，此pH值即該蛋白質的等電點(pI)。將蛋白質樣品加載至pH梯度介質上進行電泳時，它會向與其所帶電荷相反的電極方向移動。在移動過程中，蛋白分子可能獲得或失去質子，并且隨著移動的進行，該蛋白所帶的電荷數和遷移速度下降。當蛋白質遷移至其等電點pH位置時，其凈電荷數為零，在電場中不再移動。聚焦是一個與pH相關的平衡過程：蛋白質以不同的速率靠近并最終停留在它們各自的pI值；在等電聚焦過程中，蛋白質可以從各個方向移動到它的恒定位點。
第二向分離
SDS．聚丙烯酰胺凝膠電泳
雙向電泳的第二向是將IPG膠條中經過第一向分離的蛋白轉移到第二向SDS．PAGE凝膠上，根據蛋白相對分子質量或分子量(MW)大小與第一相垂直的分離。
蛋白質與十二烷基硫酸鈉(SDS)結合形成帶負電荷的蛋白質．SDS復合物，由于SDS是一種強陰離子去垢劑．所帶的負電荷遠遠超過蛋白質分子原有的電荷量，能消除不同分子之間原有的電荷差異，從而使得凝膠中電泳遷移率不再受蛋白質原有電荷的影響．而主要取決于蛋白質分子的質量大小，其遷移率與分子量的對數呈線性關系，在蛋白質組研究中。需要在同樣的條件下同時走多塊膠，這對凝膠與凝膠之間的比較十分重要。
修飾和加工
蛋白質的翻譯后修飾和加工，是指在肽鏈合成完成后進行的化學反應，如磷酸化、羥基化、糖基化、二硫鍵形成，以及目前發現的蛋白質自剪接等等，可能有一百種以上。翻譯后修飾和加工對蛋白質的正常生理功能是必需的，它們的變化往往和疾病的發生有關。用雙向凝膠電泳可以進行翻譯后修飾的研究，如用32P標記可以研究磷酸化蛋白的變化。雙向凝膠電泳中常可發現的蛋白質拖曳現象，很可能是一個蛋白的不同翻譯后修飾產物所造成的。拖曳圖像變化在疾病診斷上可能提供重要的信息。